Bu protokol, zaman içinde tek hücre düzeyinde türler arası bakteri etkileşimlerinin görüntülenmesi ve izlenmesine olanak sağlar. Bu tekniklerin ana avantajı, hücre takibi, gen ekspresyonu ve canlılık boyama dahil olmak üzere bakteri etkileşimlerini incelemek için uygulanabilirliğidir. Ayrıca, koşullar farklı organizmalar çalışma için değiştirilebilir.
Başlamak için, temiz bir 50 mililitre Erlenmeyer şişesinde 10 mililitre bakteri büyüme media%2 düşük erime agarose eriterek agarose pedleri hazırlamak. Mikrodalga agarose çözeltisi kadar kısa aralıklarla şişe, daha sonra en az 15 dakika boyunca 50 derece santigrat su banyosunda soğumasını bekleyin. 35 milimetrelik bir kapta açıklık ile bir silikon kesip hizalayın, sonra çanak çevirmek ve hafifçe çanak güvenli ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir spatula ile silikon kesip dokunun.
Agarose soğuduktan sonra, pipet 915 mikrolitre erimiş agarose kalıp içine ve ped kuru izin. Deneyi ayarlamadan en az iki saat önce mikroskop çevre odasını deneysel sıcaklığa ısıtın. Tüy bırakmayan bir mendil sıkıca yuvarlayarak nem mendilleri hazırlayın.
Haddelenmiş mendilin içine steril petri kabının içine yerleştirin ve 500 mikrolitre steril suyu doğrudan mendillere ekleyin. Tüm malzemeleri dengelemek için mendilleri, pedleri ve steril 35 milimetrelik çanak ları deneysel sıcaklığa ısıtın. Pedler kurutuldıktan sonra, pipet önceden ısıtılmış steril 35 milimetrecam kapaklı çanak altında eşit co-kültür bir mikrolitre.
Steril cımbız kullanarak agarose kalıbından kesilen silikonu çıkarın, yana doğru yatırın ve steril petriplate kapağına düşürmek için agarose pedin kenarının altına hafif çetredi bir spatula kaydırın. Pedaltında 90 derece açılı bir spatula kaydırarak ve aşılanmış kapak kayma üstüne yerleştirerek aşağı bakteri hücreleri alt tarafı ile çanak için ped aktarın. Kapak kayma karşı ped floş yapmak ve yavaşça herhangi bir hava kabarcıkları dışarı basın spatula kullanın.
Nemli mendilden fazla nemi çıkarın ve tabağa değmediğinden emin olmak için yemeğin kenarına yerleştirin. Örnek görüntüleme için hazır. Aşılanmış pedlerden önce, tüm görüntü çerçevelerini hizalamak için renk aydınlatması gerçekleştirerek mikroskobu ayarlayın.
Aşılanmış çanak hazır olduğunda, 100X objektif çanak görüntülemek ve bakteriyel sonuçlar odaklanmak. Görüntüleme yazılımındaki faz seçeneğini tıklatın ve ışık kaynağını seçerek ve çubuğu ışık yüzdesi ölçeğinde kaydırarak yayılan DIA LED ışığının yüzdesini ayarlayın. Alternatif olarak, bir pozlama süresini el ile girin.
Faz kanalına sağ tıklayarak ve Geçerli Mikroskop Ayarını Ata seçeneğini seçerek faz kanalının ayarlarını kaydedin. Floresan kullanıyorsanız, ilgi çekici kanalını seçin ve yayılan floresan ışığının yüzdesini ayarlayın, ardından daha önce açıklandığı gibi pozlama süresini ayarlayın. Alternatif olarak, açılan menüdeki diğer seçeneklerden birini seçerek dinamik aralığı ayarlamak için teklif derinliğini değiştirin.
Floresan kanalına sağ tıklayarak ve Geçerli Mikroskop Ayarını Ata seçeneğini seçerek floresan kanalının ayarlarını kaydedin. XY sekmesinde, seçili XY konumunu kaydetmek için nokta adı sütunundaki kutuyu tıklatın. Ardından, mükemmel odaklama sistemini açmak için sekmenin altındaki PFS kutusunu tıklatın.
Hücreleri odaklayın ve XY konumunun odağı kaydetmek için PFS sütunundaki oku tıklatın. Diğer tüm XY pozisyonları için bu işlemi tekrarlayın. Daha önce gösterildiği gibi aşama sekmesi altında XY pozisyonları için ayarları kaydedin.
Edinme aralığını, sıklığını ve görüntüleme süresini seçmek için zaman sekmesini tıklatın ve kutuyu işaretleyin. Ardından dalga uzunluğu sekmesini tıklatın ve görüntüleme ve kanal aralığı sıklığında kullanılacak kanalları seçmek için kutuyu işaretleyin. Ayarlarla balık tuttuğınızda, zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
S.aureus ile ortak kültürde, P.aeruginosa S.aureus kolonilerine doğru tek hücreli hareketliliği artırdığında, sallarda gruplanmış olarak kalan monokültürdeki P.aeruginosa hücreleriyle karşılaştırın. P.aeruginosa tek hücreleri saracak ve sonunda S.aureus kolonilerini istila edecek. Deney sırasında çok fazla veya çok az nem ve yanlış kurutulmuş pedler, pedin yer değiştirmesi ve hücreleri görüş alanıdışına sürüklemesi nedeniyle sürüklenmeye yol açan iki yaygın sorundur.
Fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisitesi hücrelerin ilk neden olabilir, onların floresan gevşek sonra bölme durdurmak ve sonunda sonraki çerçevelerde ölmek. Başlangıçta çok yakın olan hücreler, diğer türlerin yanıt verebileceği gizli sinyallerin bir degradesini oluşturmak için yeterli zamana sahip olmayabilirler. Bakteriyel hücre canlılığı agarose pedleri propidium iyodür ekleyerek görselleştirilmiş olabilir.
Yeşil hücreler gfp'yi aktif olarak ifade eden canlı hücreleri gösterirken, kırmızı hücreler P.aeruginosa hücresi serbest supernatant ile tedavi edildikten sonra ölü propidium iyodür lekeli hücreleri gösterir. Tek tek P.aeruginosa hücrelerinin hareketi, bir hücrenin saldan hücrelerin S.aureus kümesine ulaştığı çerçeveden ayrıldığı çerçeveden izlenir. P.aeruginosa salı ile S.aureus kümesi arasındaki mesafe Öklid mesafesini sağlarken, toplam pist uzunlukları birikmiş mesafeyi sağlar.
Her hücrenin yönelimliliği, öklid mesafesinin birikmiş uzaklığa oranı olarak hesaplanır. Yabani tip P.aeruginosa, s.Aureus'a göre daha yüksek yönlendirmeile vahşi tip S.aureus'a doğru hareket eder ve bu da yön motilitesi için gerekli olan agr-ressiyel salgılanan etkenlerden yoksundur. Bu protokolü denerken, her araştırmacının coğrafi konuma, laboratuvar ortamına ve onların özel deneyine göre canlı görüntülemede agarose pedlerinin kurutulması için koşulları optimize etmesi gerektiğini unutmamak gerekir.
Bu teknik Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus arasındaki etkileşimleri ortaya koymaktadır, daha önce toplu kültürdeki davranışlarını araştırmalarımız sırasında gizlenmiş, bu organizmaların enfeksiyonlar sırasında nasıl etkileştiğini anlamaya daha da yaklaştırıyor.
