Questo protocollo consente la visualizzazione e il tracciamento delle interazioni batteriche interspecie a livello di singola cellula nel tempo. Questo vantaggio principale delle tecniche è la sua applicabilità allo studio delle interazioni batteriche, tra cui il tracciamento cellulare, l'espressione genica e la colorazione della vitalità. Inoltre, le condizioni possono essere modificate per studiare diversi organismi.
Per iniziare, preparare le pastiglie di agarosio sciogliendo il 2% di agarosio a bassa fusione in 10 millilitri di mezzi di crescita batterica in un matraccio Erlenmeyer pulito da 50 millilitri. Microonde il pallone a brevi intervalli fino a quando l'agarosio è in soluzione, quindi lasciarlo raffreddare in un bagno d'acqua di 50 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Allineare un silicio ritagliato con l'apertura in un piatto da 35 millimetri, quindi capovolgere il piatto e toccare leggermente il silicio tagliato con una spatola per fissarlo al piatto e rimuovere eventuali bolle d'aria.
Una volta raffreddato l'agarosio, pipettare 915 microlitri di agarosio fuso nello stampo e lasciare asciugare il tampone. Riscaldare la camera ambientale del microscopio alla temperatura sperimentale almeno due ore prima di impostare l'esperimento. Preparare salviette per l'umidità arrotolando saldamente una salvietta priva di pelucchi.
Posizionare la salvietta arrotolata all'interno di una piastra di Petri sterile e aggiungere 500 microlitri di acqua sterile direttamente alle salviette. Scaldare le salviette, le pastiglie e un piatto sterile da 35 millimetri alla temperatura sperimentale al fine di equilibrare tutti i materiali. Una volta che i cuscinetti sono asciutti, pipettare un microlitro di co-coltura uniformemente sul fondo di un piatto di vetro sterile pre-riscaldato da 35 millimetri.
Rimuovere il silicone tagliato dallo stampo di agarosio usando una pinzetta sterile, inclinarlo di lato e infilare una spatola leggermente piegata sotto il bordo del tampone di agarosio per lasciarlo cadere su un coperchio sterile della piastra di petritta. Trasferire il pad sul piatto con le cellule batteriche sul lato inferiore verso il basso facendo scorrere una spatola angolata di 90 gradi sotto il pad e posizionandolo sopra lo scivolo di copertura inoculato. Utilizzare la spatola per far scivolare il pad contro lo slittamento del coperchio e premere delicatamente eventuali bolle d'aria.
Rimuovere l'umidità in eccesso dalla salvietta umida e posizionarla intorno al bordo del piatto, assicurandosi che non tocchi il pad. Il campione è ora pronto per l'imaging. Prima dei pad inoculati, impostare il microscopio eseguendo l'illuminazione a colori per allineare tutti i fotogrammi dell'immagine.
Una volta che il piatto inoculato è pronto, guarda il piatto con l'obiettivo 100X e concentrati sui risultati batterici. Fare clic sull'opzione fase nel software di imaging e regolare la percentuale di luce LED DIA emessa selezionando la sorgente luminosa e facendo scorrere la barra sulla scala percentuale della luce. In alternativa, immettere manualmente un tempo di esposizione.
Salvare le impostazioni per il canale di fase facendo clic con il pulsante destro del mouse sul canale di fase e selezionando l'opzione Assegna impostazione microscopio corrente. Se si utilizza la fluorescenza, selezionare il canale di fluorescenza di interesse e impostare la percentuale di luce di fluorescenza emessa, quindi regolare il tempo di esposizione come descritto in precedenza. In alternativa, modifica la profondità dell'offerta per regolare l'intervallo dinamico selezionando una delle altre opzioni nel menu a discesa.
Salvate le impostazioni per il canale di fluorescenza facendo clic con il pulsante destro del mouse sul canale di fluorescenza e selezionando l'opzione Assegna impostazione microscopio corrente. Nella scheda XY fare clic sulla casella nella colonna nome punto per salvare la posizione di interesse XY selezionata. Quindi fare clic sulla casella PFS nella parte inferiore della scheda per attivare il sistema di messa a fuoco perfetto.
Mettere a fuoco le celle e fare clic sulla freccia nella colonna PFS per salvare lo stato attivo della posizione XY. Ripetere questo processo per tutte le altre posizioni XY. Salvate le impostazioni per le posizioni XY nella scheda fase, come dimostrato in precedenza.
Fare clic sulla scheda ora e selezionare la casella per selezionare l'intervallo di acquisizione, la frequenza e la durata dell'imaging. Quindi fare clic sulla scheda lunghezza onda e selezionare la casella per selezionare i canali da utilizzare nell'imaging e nella frequenza dell'intervallo del canale. Quando si pescano le impostazioni, fare clic su Esegui ora per avviare l'imaging time lapse.
Rispetto alle cellule P.aeruginosa in monocoltura che rimangono raggruppate in zattere quando in co-coltura con S.aureus, P.aeruginosa ha aumentato la motilità a singola cellula verso le colonie di S.aureus. Le singole cellule di P.aeruginosa circonderanno e alla fine invaderanno le colonie di S.aureus. Troppa o troppo poca umidità durante l'esperimento e pastiglie essiccate in modo errato sono due problemi comuni che portano alla deriva a causa dello spostamento del pad e del trascinamento delle cellule fuori dal campo visivo.
Lo sbiancamento delle foto e la tossicità fotografica possono causare prima la perdita della fluorescenza delle cellule, quindi smettere di dividersi e alla fine morire nei fotogrammi successivi. Le cellule che sono inizialmente troppo vicine in prossimità potrebbero non avere abbastanza tempo per stabilire un gradiente di segnali secreti a cui altre specie possono rispondere. La vitalità delle cellule batteriche può essere visualizzata aggiungendo ioduro di propidio alle pastiglie di agarosio.
Le cellule verdi indicano cellule vive che esprimono attivamente la GFP, mentre i globuli rossi indicano cellule macchiate di ioduro propidio morto dopo essere state trattate con supernatante privo di cellule P.aeruginosa. Il movimento delle singole cellule P.aeruginosa viene tracciato dal telaio in cui una cellula lascia la zattera attraverso il telaio in cui le cellule raggiungono l'ammasso di S.aureus. La distanza tra la zattera P.aeruginosa e l'ammasso di S.aureus, fornisce la distanza euclidea, mentre le lunghezze totali della pista forniscono la distanza accumulata.
La direzione di ogni cellula è calcolata come rapporto tra la distanza euclidea e la distanza accumulata. Il tipo selvaggio P.aeruginosa si muove verso il tipo selvaggio S.aureus con una direzione significativamente più alta rispetto a S.Aureus privo di fattori secreti regolati da agr che sono necessari per la motilità direzionale. Quando si tenta questo protocollo, è importante tenere presente che ogni ricercatore dovrà ottimizzare le condizioni per l'essiccazione dei cuscinetti di agarosio nell'imaging dal vivo in base alla posizione geografica, all'ambiente di laboratorio e al loro particolare esperimento.
Questa tecnica rivela interazioni tra Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, precedentemente oscurate durante le nostre indagini sul loro comportamento nella coltura di massa, avvicinandoci alla comprensione di come questi organismi interagiscono durante le infezioni.
