このプロトコルは、一つの細胞レベルでの細菌間相互作用を時間の経過とともに可視化し追跡することを可能にする。この技術の主な利点は、細胞追跡、遺伝子発現および生存性染色を含む細菌相互作用を研究するための適用性である。さらに、条件は、異なる生物を研究するために変更することができます。
まず、10ミリリットルの細菌増殖培地で2%低融解アガロースを50ミリリットルのアーレンマイヤーフラスコで溶かしてアガロースパッドを調製する。アガロースが溶液になるまで短い間隔でフラスコを電子レンジし、50度の摂氏水浴で少なくとも15分間冷まします。35ミリメートル皿の開口部に切り取られたシリコンを合わせ、皿をひっくり返し、スパチュラで切り取ったシリコンを軽くタップして皿に固定し、気泡を取り除きます。
アガロースが冷却されると、915マイクロリットルの溶融アガロースが金型に入り、パッドを乾燥させます。実験を設定する少なくとも2時間前に、顕微鏡環境室を実験温度まで温めます。糸くずのないワイプをしっかりと巻き上げて湿度拭き取りを準備します。
滅菌ペトリ皿の中に巻いたワイプを置き、500マイクロリットルの無菌水を直接ワイプに加えます。すべての材料を平衡化するために、ワイプ、パッド、滅菌35ミリメートル皿を実験温度まで温めます。パッドが乾燥したら、ピペット1マイクロリットルの共培養は、事前に温めた無菌35ミリメートルガラスカバースリップ皿の底を均等に横切ります。
無菌ピンセットを使用してアガロース型から切り出したシリコーンを取り出し、側面に傾け、アガロースパッドの端の下でわずかに曲がったへらを滑らせて滅菌ペトリプレートの蓋に落とします。パッドの下に90度斜めのヘラをスライドさせ、接種カバースリップの上に置くことによって、細菌細胞の底側を下にして皿にパッドを移します。スパチュラを使用してカバースリップに対してパッドをフラッシュし、気泡を軽く押し出します。
湿った拭き取りから余分な水分を取り除き、それを皿の端の周りに置き、パッドに触れないようにします。これで、サンプルのイメージングの準備が整いました。パッドを接種する前に、すべての画像フレームを揃えるカラー照明を行って顕微鏡を設定します。
接種された皿が準備ができたら、100Xの目的で料理を見て、細菌の結果に焦点を当てます。イメージングソフトウェアのフェーズオプションをクリックし、光源を選択して光のパーセンテージスケールでバーをスライドさせることで、放出されるDIA LEDライトの割合を調整します。または、露出時間を手動で入力します。
フェーズチャネルを右クリックし、「現在の顕微鏡設定を割り当てる」オプションを選択して、フェーズチャネルの設定を保存します。蛍光を使用する場合は、対象の蛍光チャネルを選択し、発光する蛍光の割合を設定し、前述のとおり、露光時間を調整します。または、ドロップダウン メニューで他のオプションのいずれかを選択して、入札の深さを変更してダイナミック レンジを調整します。
蛍光チャネルを右クリックし、[現在の顕微鏡設定を割り当てる]オプションを選択して、蛍光チャネルの設定を保存します。[XY] タブで、[ポイント名] 列のボックスをクリックして、選択した XY の位置を保存します。次に、タブの下部にある PFS ボックスをクリックして、完璧なフォーカス システムをオンにします。
セルにフォーカスを設定し、[PFS] 列の矢印をクリックして、XY 位置のフォーカスを保存します。他のすべての XY 位置に対してこのプロセスを繰り返します。前に示したように、フェーズ タブの下に XY 位置の設定を保存します。
[時間]タブをクリックし、ボックスをオンにして、取得間隔、周波数、イメージング時間を選択します。次に、波の長さタブをクリックし、ボックスをチェックして、イメージングとチャンネル間隔周波数で使用するチャンネルを選択します。設定で釣り合ったら、[今すぐ実行]をクリックして、タイムラプスイメージングを開始します。
S.アウレウスとの共培養時にいかだにグループ化されたままの単一培養中のP.aeruginosa細胞と比較すると、P.aeruginosaはS.aureusコロニーに対する単細胞運動性を増加させた。P.aeruginosa単一細胞は、S.アウレウスコロニーを包囲し、最終的に侵入します。実験中に湿度が多すぎたり少なすぎたり、誤って乾燥したパッドは、パッドの移動や細胞の視野外へのドラッグによるドリフトにつながる2つの一般的な問題です。
写真の漂白と光毒性は、細胞を最初に引き起こし、蛍光を緩め、その後分裂を停止し、最終的に後続のフレームで死ぬ可能性があります。最初は近すぎて近い細胞は、他の種が応答できる分泌された信号の勾配を確立するのに十分な時間がない可能性があります。細菌細胞の生存率はアガロースパッドにヨウ化プロピジウムを添加することによって可視化することができる。
緑色の細胞はGFPを積極的に発現する生細胞を示し、赤色細胞はP.aeruginoa細胞遊離上清で処理された後に死んだヨウ化プロピジウム染色細胞を示す。個々のP.aeruginosa細胞の動きは、細胞がS.aureusクラスターに到達するフレームを通して細胞がいかだを残すフレームから追跡されます。P.aeruginosaいかだとS.aureusクラスター間の距離はユークリッド距離を提供し、トラックの全長は累積距離を提供します。
各セルの方向付けは、累積距離に対するユークリッド距離の比として計算される。野生型P.aeruginosaは、指向性運動に必要なアグリ規制された分泌因子を欠くS.アウレウスに向かうよりも有意に高い指向性を有する野生型S.アウレウスに向かって移動する。このプロトコルを試す際には、各研究者が、地理的位置、実験室環境、およびそれらの特定の実験に基づいて、ライブイメージングでアガロースパッドを乾燥させる条件を最適化する必要があることを覚えておいてください。
この技術は、バルク培養におけるそれらの行動の調査中に以前に隠されていたシュードモナス・エルギノーサと黄色ブドウ球菌との相互作用を明らかにし、これらの生物が感染中にどのように相互作用するかを理解することに近づく。
