פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ומעקב אחר אינטראקציות חיידקיות בין-מיניות ברמת התא הבודד לאורך זמן. יתרון עיקרי זה של טכניקות הוא הכדאיות שלה ללמוד אינטראקציות חיידקים, כולל מעקב אחר תאים, ביטוי גנים וכתמי כדאיות. בנוסף, ניתן לשנות את התנאים כדי לחקור אורגניזמים שונים.
כדי להתחיל, להכין רפידות אגרוז על ידי המסת 2% להמיס נמוך agarose ב 10 מיליליטר של מדיה צמיחה חיידקית בבקבוק נקי 50 מיליליטר ארלנפייר. יש לחמם במיקרוגל את הבקבוק במרווחי זמן קצרים עד שהאגרוז יתפתר, ואז לתת לו להתקרר באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. ליישר סיליקון לחתוך עם הפתח בצלחת 35 מילימטר, ולאחר מכן להפוך את המנה קלות הקש על הסיליקון לחתוך עם מרית כדי לאבטח אותו לצלחת כדי להסיר את כל בועות האוויר.
ברגע שהתעוררות התקררה, פיפטה 915 מיקרוליטרים של מותכת התעוררו לתוך התבנית ולתת את הפנקס להתייבש. מחממים את התא הסביבתי של המיקרוסקופ לטמפרטורה הניסיונית לפחות שעתיים לפני הקמת הניסוי. הכינו מגבוני לחות על ידי גלגול הדוק של מגבון ללא מוך.
מניחים את המחיקה המגולגלת בתוך צלחת פטרי סטרילית ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של מים סטריליים ישירות למגבונים. מחממים את המגבונים, הרפידות ותבשיל סטרילי של 35 מ"מ לטמפרטורה הניסיונית כדי לצייד את כל החומרים. לאחר הרפידות יבשות, פיפטה מיקרוליטר אחד של תרבות שיתוף באופן שווה על פני החלק התחתון של צלחת זכוכית סטרילית 35 מילימטר מחומם מראש מכסה צלחת.
הסר את הסיליקון לגזור מן התבנית agarose באמצעות פינצטה סטרילית, להטות אותו הצידה להחליק מרית כפופה מעט מתחת לקצה כרית agarose להפיל אותו על מכסה petriplate סטרילי. מעבירים את הפנקס לצלחת עם התאים החיידקיים בצד התחתון למטה על ידי החלקת מרית זוויתית של 90 מעלות מתחת לפנקס ומניחים אותה על גבי החלקת הכיסוי החוסנת. השתמש מרית כדי להפוך את כרית סומק על החלקת הכיסוי בעדינות ללחוץ את כל בועות האוויר.
הסר לחות עודפת מן לנגב לח למקם אותו סביב קצה המנה, לוודא שזה לא לגעת כרית. הדגימה מוכנה כעת להדמיה. לפני רפידות מחוסנות, הגדר את המיקרוסקופ על-ידי ביצוע תאורת צבע ליישור כל מסגרות התמונה.
לאחר המנה מחוסן מוכן, להציג את המנה עם מטרה 100X ולהתמקד בתוצאות החיידקים. לחץ על אפשרות השלב בתוכנת ההדמיה והתאם את אחוז תאורת ה-DIA LED הנפלטת על-ידי בחירת מקור האור והזזת הסרל בסולם אחוזי האור. לחלופין, הזן זמן חשיפה באופן ידני.
שמור את ההגדרות עבור ערוץ הפאזה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על ערוץ הפאזה ובחירה באפשרות הקצאת הגדרת מיקרוסקופ נוכחית. אם אתם משתמשים בנורסצנטיות, בחרו את ערוץ ההתעניינות הפלואורסצנטי והגדירו את אחוז האור הפלואורסצנטי הנפלט, ולאחר מכן התאימו את זמן החשיפה כפי שתואר קודם לכן. לחלופין, שנו את עומק הצעת המחיר להתאמת הטווח הדינמי על-ידי בחירת אחת מהאפשרויות האחרות בתפריט הנפתח.
שמור את ההגדרות עבור ערוץ הפלואורסצנטיות על ידי לחיצה ימנית על ערוץ הפלואורסצנטיות ובחירה באפשרות הקצאת הגדרת מיקרוסקופ נוכחית. בכרטיסיה XY, לחץ על התיבה בעמודת שם הנקודה כדי לשמור את מיקום ה- XY שנבחר כמעניין. לאחר מכן לחץ על התיבה PFS בתחתית הכרטיסיה כדי להפעיל את מערכת המיקוד המושלמת.
מקד את התאים ולחץ על החץ בעמודה PFS כדי לשמור את המוקד של מיקום ה- XY. חזור על תהליך זה עבור כל מיקומי XY האחרים. שמור את ההגדרות עבור מיקומי XY תחת הכרטיסיה 'פאזה' כפי שהודגם קודם לכן.
לחץ על כרטיסיית השעה וסמן את התיבה כדי לבחור את מרווח הזמן לרכישה, התדירות ומשך ההדמיה. לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה אורך גל וסמן את התיבה כדי לבחור ערוצים לשימוש בהדמיה ותדירות מרווח בין ערוצים. כאשר דג עם ההגדרות, לחץ על הפעל כעת כדי ליזום את הדמיית זמן ההדמיה.
השווה לתאי P.aeruginosa במונוקולטורה שנותרו מקובצים ברפסודות כאשר בתרבות שיתוף עם S.aureus, P.aeruginosa הגדילה תנועתיות תא יחיד כלפי מושבות S.aureus. P.aeruginosa תאים בודדים יקיף ובסופו של דבר לפלוש מושבות S.aureus. יותר מדי או מעט מדי לחות במהלך הניסוי רפידות מיובשות באופן שגוי הן שתי בעיות נפוצות שמובילות להיסחף עקב הזזת כרית וגרירת התאים מחוץ לשדה המבט.
הלבנת תמונות ורעילות צילום יכולות לגרום לתאים קודם, לאבד את הפלואורסצנטיות שלהם ואז להפסיק להתחלק ובסופו של דבר למות במסגרות הבאות. ייתכן שלתאים הקרובים מדי בסמיכות אין די זמן לקבוע שיפוע של אותות מופרשים שאליהם מינים אחרים יכולים להגיב. ניתן לדמיין את הכדאיות של תאים חיידקיים על ידי הוספת פרופידיום יודיד לריפידות אגרוז.
תאים ירוקים מצביעים על תאים חיים המביעים באופן פעיל GFP, בעוד תאים אדומים מצביעים על תאים מוכתמים של פרופידיום יודיד מת לאחר שטופלו בתא P.aeruginosa ללא על-טבעי. התנועה של תאים בודדים P.aeruginosa נמצאים במעקב מהמסגרת שבה תא עוזב את הרפסודה דרך המסגרת שבה התאים מגיעים לאשכול S.aureus. המרחק בין רפסודת P.aeruginosa לבין צביר S.aureus, מספק את המרחק האוקלידי, בעוד אורכי המסלול הכוללים מספקים את המרחק המצטבר.
ההכוונה של כל תא מחושבת כיחס בין המרחק האוקלידי למרחק המצטבר. סוג פראי P.aeruginosa נע לכיוון סוג פראי S.aureus עם כוונה גבוהה משמעותית מאשר לכיוון S.Aureus חסר גורמים מופרשים מווסתים agr אשר נחוצים תנועתיות כיוונית. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי כל חוקר יצטרך לייעל את התנאים לייבוש רפידות אגרוז בהדמיה חיה המבוססת על מיקום גיאוגרפי, סביבת מעבדה והניסוי המסוים שלהם.
טכניקה זו חושפת אינטראקציות בין Pseudomonas aeruginosa ו Staphylococcus aureus, שהוסתרו בעבר במהלך החקירות שלנו על התנהגותם בתרבות בתפזורת, מה שמקרב אותנו להבנת האופן שבו אורגניזמים אלה מתקשרים במהלך זיהומים.
