Ce protocole permet la visualisation et le suivi des interactions bactériennes inter-espèces au niveau d’une seule cellule au fil du temps. Ce principal avantage des techniques est son applicabilité à l’étude des interactions bactériennes, y compris le suivi cellulaire, l’expression des gènes et la coloration de la viabilité. En outre, les conditions peuvent être modifiées pour étudier différents organismes.
Pour commencer, préparez des coussinets d’agarose en faisant fondre l’agarose à faible fond de 2 % dans 10 millilitres de liquide de croissance bactérienne dans un flacon Erlenmeyer propre de 50 millilitres. Cuire au micro-ondes le flacon à intervalles courts jusqu’à ce que l’agarose soit en solution, puis laisser refroidir dans un bain d’eau de 50 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Alignez un silicium découpé avec l’ouverture dans un plat de 35 millimètres, puis retournez le plat et appuyez légèrement sur le silicium découpé à l’aide d’une spatule pour le fixer au plat et enlever les bulles d’air.
Une fois l’agarose refroidie, pipette 915 microlitres d’agarose fondue dans le moule et laisser sécher la garniture. Réchauffez la chambre environnementale du microscope à la température expérimentale au moins deux heures avant la mise en place de l’expérience. Préparez des lingettes d’humidité en roulant étroitement vers le haut d’un lingette sans peluche.
Placer l’lingette roulée à l’intérieur d’une boîte de Pétri stérile et ajouter 500 microlitres d’eau stérile directement aux lingettes. Réchauffer les lingettes, les tampons et un plat stérile de 35 millimètres à la température expérimentale afin d’équilibrer tous les matériaux. Une fois les garnitures sèches, pipette un microlitre de co-culture uniformément à travers le fond d’un plat stérile préchauffé de 35 millimètres de couverture en verre.
Retirez le silicone coupé du moule agarose à l’aide d’une pince stérile, inclinez-le sur le côté et glissez une spatule légèrement pliée sous le bord de la garniture agarose pour la déposer sur un couvercle de pétriplate stérile. Transférer le tampon dans le plat avec les cellules bactériennes du bas côté vers le bas en glissant une spatule inclinée à 90 degrés sous le tampon et en le plaçant sur le dessus de la feuille de couverture inoculée. Utilisez la spatule pour faire rincer le tampon contre le glissement du couvercle et appuyez doucement sur les bulles d’air.
Retirez l’excès d’humidité de l’essuie-linge humide et placez-le sur le bord du plat, en vous assurant qu’il ne touche pas le tampon. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie. Avant les tampons inoculés, configurez le microscope en effectuant l’éclairage des couleurs pour aligner tous les cadres d’image.
Une fois que le plat inoculé est prêt, voir le plat avec 100X objectif et se concentrer sur les résultats bactériens. Cliquez sur l’option de phase dans le logiciel d’imagerie et ajustez le pourcentage de lumière LED DIA émise en sélectionnant la source lumineuse et en glissant la barre sur l’échelle de pourcentage de lumière. Alternativement, entrez manuellement un temps d’exposition.
Enregistrez les paramètres du canal de phase en cliquant à droite sur le canal de phase et en sélectionnant l’option Assign Current Microscope Setting. Si vous utilisez la fluorescence, sélectionnez le canal d’intérêt de fluorescence et définissez le pourcentage de lumière de fluorescence émise, puis ajustez le temps d’exposition tel qu’il a été décrit précédemment. Alternativement, modifiez la profondeur de l’enchère pour ajuster la plage dynamique en sélectionnant l’une des autres options dans le menu drop down.
Enregistrez les paramètres du canal de fluorescence en cliquant à droite sur le canal de fluorescence et en sélectionnant l’option Assign Current Microscope Setting. Dans l’onglet XY, cliquez sur la case dans la colonne de nom de point pour enregistrer la position d’intérêt XY sélectionnée. Cliquez ensuite sur la boîte PFS en bas de l’onglet pour activer le système de mise au point parfait.
Concentrez les cellules et cliquez sur la flèche dans la colonne PFS pour enregistrer la mise au point de la position XY. Répétez ce processus pour toutes les autres positions XY. Enregistrez les paramètres des positions XY sous l’onglet phase comme démontré précédemment.
Cliquez sur l’onglet temps et cochez la case pour sélectionner l’intervalle d’acquisition, la fréquence et la durée de l’imagerie. Cliquez ensuite sur l’onglet longueur d’onde et cochez la case pour sélectionner les canaux à utiliser dans l’imagerie et la fréquence des intervalles de canal. Lorsque vous pêchez avec les paramètres, cliquez sur Exécuter maintenant pour lancer l’imagerie time lapse.
Comparez aux cellules de P.aeruginosa dans la monoculture qui restent groupées dans des radeaux quand dans la co-culture avec S.aureus, P.aeruginosa a augmenté la motilité de cellules simples vers des colonies de S.aureus. Les cellules individuelles de P.aeruginosa entoureront et finiront par envahir les colonies de S.aureus. Trop ou trop peu d’humidité pendant l’expérience et les tampons mal séchés sont deux problèmes courants qui conduisent à la dérive due au déplacement du tampon et à la traînée des cellules hors du champ de vision.
Le blanchiment des photos et la toxicité de la photo peuvent d’abord causer des cellules, perdre leur fluorescence, puis cesser de se diviser et éventuellement mourir dans les cadres suivants. Les cellules qui sont initialement trop proches peuvent ne pas avoir suffisamment de temps pour établir un gradient de signaux sécrétés auxquels d’autres espèces peuvent répondre. La viabilité des cellules bactériennes peut être visualisée en ajoutant de l’iodure de propidium aux coussinets d’agarose.
Les cellules vertes indiquent les cellules vivantes exprimant activement GFP, tandis que les globules rouges indiquent les cellules tachées mortes d’iodure de propidium après avoir été traitées avec le supernatant libre de cellules de P.aeruginosa. Le mouvement des cellules P.aeruginosa individuelles est suivi à partir du cadre dans lequel une cellule quitte le radeau à travers le cadre dans lequel les cellules atteignent le cluster S.aureus. La distance entre le radeau de P.aeruginosa et l’amas de S.aureus, fournissent la distance euclidean, tandis que les longueurs totales de la voie fournissent la distance accumulée.
La direction de chaque cellule est calculée comme un rapport entre la distance euclidean et la distance accumulée. Le type sauvage P.aeruginosa se déplace vers le type sauvage S.aureus avec une direction significativement plus élevée que vers S.Aureus sans facteurs sécrétés agr-réglés qui sont nécessaires pour la motilité directionnelle. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de garder à l’esprit que chaque chercheur devra optimiser les conditions de séchage des coussinets d’agarose dans l’imagerie vivante en fonction de l’emplacement géographique, de l’environnement de laboratoire et de leur expérience particulière.
Cette technique révèle des interactions entre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, précédemment obscurcies lors de nos investigations sur leur comportement en culture en vrac, nous rapprochant de la compréhension de la façon dont ces organismes interagissent pendant les infections.
