Куриный цилиарный ганглия, является структура локализована в задней части глаза, рядом с зрительным нервом в хороидной трещины. И цилиарные ганглия нейронов, принадлежат к парасимпатической нервной системы, и холинергических нейронов, и, таким образом, они могут установить холинергические синапсы. Цилиарный ганглий состоит из огромной популяции цилиарных нейронов и хороидных нейронов, которые структурно и функционально отличаются.
Таким образом, цилиарные нейроны innervates внутриглазной мышцы, и хороидных нейронов innervates настроение мышцы в глазу. И в первые дни в культуре цилиарные ганглия нейроны представляют мевральной морфологии, и после них они начинают переходить в однополярное состояние, где один из невритов расширяется и образует аксон. Одним из наиболее распространенных исследований с использованием цилиндрических нейронов ганглия, является изучение нервно-мышечных синапсов, которые являются холинергические синапсы, и использование цилиарных нейронов ганглия стала хорошей альтернативой, по сравнению с предыдущими моделями, в связи с тем, что нейронная популяция получена, является однородным в том смысле, что, все нейроны холинергические, и, таким образом, они могут установить функциональные клетки , что не происходит, когда мы работаем с нейрональной популяции, то есть не совсем холинергической.
Идентификация и вскрытие цилиарного ганглия может быть довольно сложной задачей для кого-то делать это в первый раз, так что здесь мы предоставляем шаг за шагом протокол, для соответствующей идентификации и вскрытия цилиарного ганглия, а также руководящие принципы для успешной культуры этих нейронов. Для подготовки крышки, вам нужно, 13 миллиметров стеклянные крышки, кислотоустойчивый контейнер, 65%nitric кислоты, пинцет, Милли-З воды, 75% этанола и орбитального шейкера. Подготовка обложек для первичных культур должна быть сделана за два дня до процедуры.
Поместите нужное количество стеклянных крышки, внутри кислотоустойчивого контейнера, и добавить 65%nitric кислоты, пока все coverslips покрыты. Поместите контейнер в орбитальный шейкер и инкубировать на ночь при комнатной температуре с возбуждением. На следующий день, тщательно удалить азотную кислоту, и звезды для повторного тусовки.
Вымойте крышки, добавьте в контейнер воду Милли-З. Еще раз, поместив агитацию на 30 минут, отбросьте раствор стирки и повторите этот процесс пять раз. Промыть крышки в два раза с использованием 75% этанола.
Тщательно раздельно и поместите отдельные крышки в металлическую стойку, покрытую алюминиевой фольгой, и инкубировать при 50 градусах, в течение 10-15 минут, или пока они полностью высохнут. Стерилизовать крышки в ультрафиолетовом свете, в течение 10 до 15 минут. Для покрытия coverslips, вам нужно, стерильные стеклянные крышки, 24-Ну пластины, стерильные пинцеты, 0,1 миллиграмма на миллилитр PDL раствор, стерильная вода, 10 микрограмм на миллилитр ламинина раствор, простой нейробазальной среды, и цилиарный ганглион полной среде.
Покрытие крышки, должно быть сделано за день до процедуры. Используя стерильный пинцет, поместите одну крышку в каждый колодец 24-Ну пластины, добавить 500 микролитров поли диасинг раствора, при концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр, и инкубировать на ночь при 37 градусах. На следующий день, мыть крышки три раза с стерильной водой, отбросить воду, и добавить 350 микролитров раствора ламинина в концентрации 10 микрограмм на миллилитр к каждой хорошо.
Поместите в инкубатор, при 37 градусах в течение двух часов. После этого времени, и перед покрытием клеток, удалить раствор ламинина, и мыть дважды с 300 микролитров простой нейробазальной среды. Добавьте 300 микролитров полной среды и поместите в инкубатор при 37 градусах и 5%CO2, пока не будете готовы к пластине клеток.
Для процедуры вскрытия вам понадобится куриные яйца в эмбриональный день семь, 75%этанол, миппы вскрытия Номер 545 и номер 55, ножницы, ложка, рассечение чашек Петри с черным дном и ледяным раствором HBSS. Убедитесь в том, чтобы стерилизовать все инструменты вскрытия в 75%этанола. Яйца должны храниться при 16 градусах, прежде чем инкубируется в яичном инкубаторе, при 37,7 градусах, в течение семи дней или другой желаемой эмбриональной стадии.
В день процедуры удалите яйца из инкубатора, распылите яйца 75%этанолом. Получить верхней части яйца с помощью ножниц, и тщательно вынул эмброй с помощью ложки. Поместите эмбрион в чашку Петри с ледяным раствором HBSS и немедленно отделив голову от тела, разрезая область шеи.
Затем перенесите голову в новую чашку Петри с чистым ледяным раствором HBSS. Как только эмбрион удаляется из яйцеклетки, он способен производить протеасы, которые отвечают за гибель клеток. Поэтому важно, чтобы отделить голову от тела как можно быстрее, как только эмбрион находится за пределами яйца, чтобы свести к минимуму гибель клеток.
Также очень важно держать голову эмбриона в ледяном растворе HBSS. Держите голову эмбриона вверх, и исправить его в клюве цыпленка, а затем начать удалять тонкий слой кожи вокруг глаза. Аккуратно удалите глаз, аккуратно вращая его от головы.
И, отделяя глаз от головы цыпленка, обратите внимание на оптический нерв, который отделяется. Держите глаз с задней стороны вверх, и обратите внимание на цилиарный ганглия, рядом с датчиком зрительного нерва и хороидной трещины. Преганглионный нерв все еще может быть прикреплен к цилиарной ганглия, облегчая его идентификацию.
Рассеките цилиарный ганглия, от каждого глаза, и очистить его очень хорошо, удалив избыток ткани. Перенесите расчлененные ганглии в чашку Петри с раствором HBSS на льду. Для того, чтобы иметь выход около 1 миллиона клеток на миллилитр, вы должны вскрыть около 70 ганглиев, а также иметь в виду, что популяция клеток, полученных, имеет невнонные клетки, а также, так что для того, чтобы уменьшить количество не-нейрональных клеток, а также увеличить чистоту вашей невранальной популяции, важно, чтобы очистить цилиарные ганглии очень хорошо , удаление всех лишних тканей.
Для диссоциации тканей, вам нужно, 24-Ну пластины, 0,1%tripsin раствор, неполный цилиарный ганглиев среды, огонь полированной стеклянной пастер пипетки, и пластиковые пастер пипетки. Предварительно мокрый стерильный пластиковый пастер пипетка, и собрать все цилиарные ганглии на 15 ML трубки, и центрифуга в течение двух минут при 200 Gs.Carefully, удалить все HBSS среды, используя пастер пипетку, чтобы удалить больший объем, а затем, когда вы ближе к гранулы, использовать микро pipette. Добавьте один миллилитр раствора 0,1%tripsin и инкубировать в течение 20 минут при 37 градусах в водяной бане.
Центрифуга в течение двух минут, при 200 Gs.Immediately, удалить трисвин раствор, и добавить один миллилитр неполной среды. Сыворотка в неполной среде немедленно остановит активность трипсина. Центрифуга в течение двух минут, при 200 Gs, и удалить все среды.
Добавьте 500 микролитров полной среды и начните диссоциацию тканей с помощью микропиптера P1000. Начните с трубы вверх и вниз, от 10 до 15 раз, а затем, переключиться на огонь полированной стеклянной пастер пипетки, и снова, пипетка вверх и вниз от 10 до 15 раз. Подвеска клетки должна стать размытой, как признак успешной диссоциации тканей.
Необходимый объем для диссоциации клеток зависит от количества цилиарных ганглиев, полученных в этом, и размера гранул. Когда трубопровод вверх и вниз, чтобы размежевать ткани, важно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, это позволит свести к минимуму потерю клеток. После повторного перерасхода клеток, вы можете оставить ячейки подвески на льду до покрытия.
Определите плотность клеток с помощью трипан-голубого раствора в камере нойбауэра. Это подвеска свинцовой клетки в полной среде, с 5FTU, при желаемой плотности и пластины 500 микролитров клеток на колодец. Инкубационые клетки при 37 градусах и 5%CO2.
Убедитесь в том, чтобы проверить нашу культуру каждый день и следить за развитием клеток. Ciliary клетки ганглиев развиваются довольно быстро в пробирке, и через один день, мы уже можем видеть некоторые невриты, простирающиеся от тела клетки. После семи-восьми дней в пробирке, нейронная сеть очень хорошо создана, и клетки могут поддерживаться, по крайней мере 15 дней.
После одного дня в пробирке, цилиарные нейроны ганглия показывают многополярную мифологию. Тем не менее, расширение невритов происходит быстро в нейронах заметно создали нейронной сети, уже через 24 часа. В пробирке, цилиарные нейроны ганглия отвечают за иннервации мышц в глазу.
Таким образом, эти нейронные культуры очень хорошо подходят для изучения нервно-мышечных синапсов. Для этого, цилиарные ганглия нейроны могут быть поцарены на верхней части мышечных клеток. Здесь мы показываем успешную культуру, глаз стекловидного тела, CG нейронов, на верхней части глаза V7 цыпленок пектральных нейронов мышц.
Синаптический маркер пузырьков, SV2, показывают активные синапсы, которые устанавливаются между аксонами нейронов CG и мышечными волокнами, легко идентифицированными несколькими ядрами. Ciliary ganglion нейроны, полученные с помощью этого протокола подходят для иммуноцитохимии, электрофизиологии, и выживания эссе среди других. Этот протокол вскрытия, дает очень низкое количество нейронов, но если сделать правильно, обеспечит чистую популяцию холинергических нейронов.
Очень важно, чтобы каждый ганглий очень хорошо очищается и избыток ткани удаляется. Для этого следует использовать высококачественные инструменты, чтобы эту ткань можно было удалить, чтобы предотвратить заражение не нейрональными клетками. Возраст эмбриона будет определять успех нашего протокола.
В идеале вскрытие должно проводиться между E7 и E8. Этот момент времени очень важен, потому что на данном этапе, смерть клеток развития, что происходит обычно в пробирке еще не произошло. Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение этих не нейрональных клеток, мы используем 5FTU в культурных средствах массовой информации, чтобы свести к минимуму рост глиальных клеток и фибробластов. Эта клеточная модель обеспечивает отличную альтернативу для изучения вашего nueromusclar болезни.
На основе этого протокола можно решить дополнительные научные вопросы, например, как локализация субклеточных специфических карбонатов и специфических белков регулирует образование и функционирование синапса. Кроме того, это довольно легко установить нервной мышцы совместно культур для решения дальнейших вопросов, таких как изучение нервно-мышечных заболеваний.
