O gânglio ciliar de frango é uma estrutura localizada na parte posterior do olho, adjacente ao nervo óptico na fissura coroóide. E os neurônios gânglios ciliares pertencem ao sistema nervoso parassimpático, e são neurônios colinérgicos, e assim podem estabelecer sinapses colinérgicas. O gânglio ciliar consiste em uma enorme população de neurônios ciliares e neurônios coroidais, que são estrutural e funcionalmente distintos.
Assim, os neurônios ciliar inervas músculo intraocular, e neurônios coroidais inerva músculo humor no olho. E nos primeiros dias na cultura, os neurônios ciliares de gânglio apresentam uma morfologia multipolar, e depois destes, eles começam a transição para um estado unipolar, onde um dos neurites se estende e forma o axônio. Um dos estudos mais comuns usando neurônios de gânglios ciliares, é um estudo de sinapses neuromusculares, que são sinapses colinérgicas, e o uso de neurônios gânglios ciliares tornou-se uma boa alternativa, em comparação com os modelos anteriores, devido ao fato de que a população neuronal obtida, é homogênea no sentido de que, todos os neurônios são colinérgicos, e assim podem estabelecer sinapses funcionais com as células musculares , o que não acontece quando estamos trabalhando com uma população neuronal, que não é totalmente colinérgica.
A identificação e dissecação do gânglio ciliar pode ser bastante desafiadora para alguém que o faz pela primeira vez, por isso aqui fornecemos um protocolo passo a passo, para a identificação e dissecação adequadas do gânglio ciliar, bem como as diretrizes para o sucesso da cultura desses neurônios. Para a preparação das tampas, você precisará de 13 milímetros de tampas de vidro, um recipiente resistente a ácido, ácido 65% nítrico, pinças, água Milli-Q, 75% etanol e um agitador orbital. A preparação dos deslizamentos para culturas primárias deve ser feita dois dias antes do procedimento.
Coloque o número desejado de tampas de vidro, dentro de um recipiente resistente ao ácido, e adicione 65% de ácido nítrico, até que todas as tampas estejam cobertas. Coloque o recipiente em um agitador orbital e incuba durante a noite à temperatura ambiente com agitação. No dia seguinte, remova cuidadosamente o ácido nítrico e estrela para reutilização.
Lave as tampas, adicione água Milli-Q ao recipiente. Mais uma vez, colocando agitação por 30 minutos, descarte a solução de lavagem e repita esse processo cinco vezes. Enxágüe as tampas duas vezes usando 75% de etanol.
Separe cuidadosamente e coloque tampas individuais em um rack de metal, coberto com papel alumínio, e incubar a 50 graus, por 10 a 15 minutos, ou até que estejam totalmente secos. Esterilize as tampas na luz UV, por 10 a 15 minutos. Para revestir as tampas, você precisará de tampas de vidro estéreis, uma placa de 24-Well, pinças estéreis, 0,1 miligramas por solução PDL mililitro, água estéril, uma solução de 10 microgramas por mililitro laminina, meio neurobásal simples e meio de gânglio ciliar completo.
O revestimento das tampas deve ser feito um dia antes do procedimento. Usando uma pinça estéril, coloque uma mancha de cobertura em cada poço de uma placa 24-Well, adicione 500 microliters de solução poli dialipto, a uma concentração de 0,1 miligramas por mililitro, e incubar durante a noite a 37 graus. No dia seguinte, lave as tampas três vezes com água estéril, descarte a água e adicione 350 microliters da solução de laminina a uma concentração de 10 microgramas por mililitro em cada poço.
Coloque em uma incubadora, a 37 graus por duas horas. Após esse tempo, e antes do revestimento celular, remova a solução de laminina e lave duas vezes com 300 microliters de meio neurobásal simples. Adicione 300 microliters de meio completo, e coloque em uma incubadora, a 37 graus e 5% de CO2, até que você esteja pronto para as células da placa.
Para o procedimento de dissecção, você precisará de ovos de galinha no sétimo dia, 75% de etanol, asseps de dissecção número 545 e número 55, tesoura, uma colher, placas de petri de dissecção com fundo preto e solução HBSS gelada. Certifique-se de esterilizar todas as ferramentas de dissecção em 75% de etanol. Os ovos devem ser armazenados a 16 graus antes de serem incubados em uma incubadora de ovos, a 37,7 graus, durante sete dias, ou outro estágio embrionário desejado.
No dia do procedimento, retire os ovos da incubadora, pulverize os ovos com 75% de etanol. Pegue a parte superior do ovo usando uma tesoura, e retire cuidadosamente o embroy usando uma colher. Coloque o embrião, em uma placa de petri com solução hbss gelada, e separe imediatamente a cabeça do corpo, cortando na região do pescoço.
Em seguida, transfira a cabeça para uma nova placa de petri com solução HBSS gelada limpa. Assim que o embrião é removido do óvulo, ele é capaz de produzir proteases que são responsáveis pela morte celular. Por isso, é importante separar a cabeça do corpo o mais rápido possível, uma vez que o embrião está fora do ovo para minimizar a morte celular.
Também é muito importante manter a cabeça do embrião na solução HBSS gelada. Segure a cabeça do embrião para cima, e fixá-lo no bico do filhote, e então começar a remover a fina camada de pele ao redor do olho. Com cuidado, remova o olho girando-o suavemente para longe da cabeça.
E enquanto separa o olho da cabeça da garota, note o nervo óptico sendo seccionado. Mantenha o olho com o lado posterior para cima, e observe o gânglio ciliar, adjacente ao nervo óptico do sensor e à fissura coroóide. O nervo pré-brilhante ainda pode estar ligado ao gânglio ciliar, facilitando sua identificação.
Dissecar o gânglio ciliar, de cada olho, e limpá-lo muito bem removendo o excesso de tecido. Transfira o gânglio dissecado para uma placa de petri com solução HBSS no gelo. Para ter um rendimento de cerca de 1 milhão de células por mililitro, você deve dissecar cerca de 70 gânglios, e também ter em mente que a população celular obtida, tem células não neuronais também, então, a fim de diminuir o número de células não-neuronais, e também para aumentar a pureza de sua população neuranal, é importante limpar a grália ciliar muito bem , removendo todo o excesso de tecido.
Para a dissociação tecidual, você precisará de uma placa de 24-Well, solução tripsin 0,1%, meio gânglio ciliar incompleto, uma pipeta pasteur de vidro polido de fogo e uma pipeta pasteur de plástico. Pré-molhar uma pipeta pasteur de plástico estéril, e coletar todas as gânglios ciliares em um tubo de 15 ML, e centrífuga por dois minutos a 200 Gs.Cuidadosamente, remova todo o meio HBSS, usando uma pipeta pasteur para remover um volume maior, e então, quando estiver mais perto da pelota, use uma micro pipeta. Adicione um mililitro de solução tripsin de 0,1% e incubar por 20 minutos, a 37 graus em um banho de água.
Centrifugar por dois minutos, a 200 Gs.Imediatamente, remova a solução tripsin e adicione um mililitro de meio incompleto. O soro no meio incompleto interromperá imediatamente a atividade de trippsina. Centrifugar por dois minutos, a 200 Gs, e remover todos os meios.
Adicione 500 microliters de meio completo e inicie a dissociação do tecido usando uma micropipette P1000. Comece por pipetting para cima e para baixo, 10 a 15 vezes, e depois, mude para uma pipeta pasteur de vidro polido de fogo, e novamente, pipeta para cima e para baixo 10 a 15 vezes. A suspensão celular deve ficar embaçada, como sinal de dissociação de tecido bem sucedida.
O volume necessário para dissociar células depende do número de gânglios ciliares obtidos neste, e do tamanho da pelota. Ao se sobressar para cima e para baixo para dissociar um tecido, é importante evitar a formação de bolhas de ar, isso minimizará a perda celular. Depois de reutilizar células, você pode deixar a suspensão da célula no gelo até chapeamento.
Determine a densidade celular usando uma solução azul trypan, na câmara de neubauer. Essa suspensão de célula de chumbo em meio completo, com 5FTU, na densidade desejada e placa 500 microliters de células por poço. Incubar células a 37 graus e 5% de CO2.
Certifique-se de verificar nossa cultura todos os dias e acompanhar o desenvolvimento das células. As células ciliares se desenvolvem rapidamente in vitro, e depois de um dia, já podemos ver alguns neurites se estendendo do corpo celular. Após sete a oito dias in vitro, a rede neuronal é muito bem estabelecida, e as células podem ser mantidas por pelo menos 15 dias.
Depois de um dia in vitro, neurônios ciliares mostram uma mitologia multipolar. No entanto, a extensão de neurites ocorre rapidamente nos neurônios visivelmente estabelecidos a rede neuronal, já após 24 horas. In vitro, os neurônios gânglios ciliares são responsáveis pela inervação do músculo no olho.
E assim, essas culturas neuronais.são muito adequadas para o estudo de sinapses neuromusculares. Para isso, neurônios ciliares podem ser banhados em cima de células musculares. Aqui, mostramos uma cultura bem sucedida.dos neurônios vítreos do olho, cg, em cima dos neurônios musculares espectrais do filhote de V7.
Marcador de vesícula sináptica, SV2, mostram sinapses ativas que são estabelecidas entre os axônios dos neurônios CG, e as fibras musculares, facilmente identificadas pelos múltiplos núcleos. Os neurônios de gânglio ciliar obtidos com este protocolo são adequados para ensaios de imunocitoquímica, eletrofisiologia e sobrevivência, entre outros. Este protocolo de dissecção, produz um número muito baixo de neurônios, mas se feito corretamente, fornecerá a população pura de neurônios colinérgicos.
É muito importante que cada gânglio seja muito bem limpo e o excesso de tecido seja removido. Para isso, devem ser utilizados instrumentos de alta qualidade, para que este tecido possa ser removido para evitar a contaminação por células não neuronais. A idade do embrião determinará o sucesso do nosso protocolo.
O ideal é que a dissecção seja realizada entre e7 e E8. Este ponto de tempo é muito importante porque, nesta fase, a morte celular do desenvolvimento que ocorre normalmente in vitro ainda não ocorreu. Para minimizar a contaminação dessas células não neuronais, usamos o 5FTU na mídia cultural para minimizar o crescimento de células gliais e fibroblastos. Este modelo de adega fornece uma excelente alternativa para estudar sua doença nueromusclar.
Com base neste protocolo, questões científicas adicionais podem ser abordadas, por exemplo, como a localização subcelular de carbonatos específicos e proteínas específicas regulam a formação e a função da sinapse. Além disso, é bastante fácil estabelecer co-culturas musculares nervosas para abordar outras questões como o estudo de doenças neuromusculares.
