مع انفجار المواد الجديدة للتطبيقات الطبية ، يجب إجراء الفحص الأولي بشكل منهجي ، لذلك يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة أساسية للباحثين الذين يهدفون إلى تطوير وتوصيف المواد الحيوية الجديدة. تسمح المنهجية بالتقييم الكمي والنوعي للسمية الخلوية والنشاط الحيوي للمواد الحيوية والتركيبات الصيدلانية ، الصلبة والسائلة على حد سواء. بعد التعرض للخلايا ، يمكن إجراء العديد من المقايسات التكميلية.
يمكن أن يكون لإنشاء السمية الخلوية للمواد الحيوية آثار ذات صلة بالممارسة السريرية. على سبيل المثال ، قد تمكن هذه المعرفة الطبيب من اختيار أنسب مادة حيوية لمريض أو حالة معينة. يسمح هذا البروتوكول بتوصيف المواد الحيوية الجديدة في مجالات مختلفة مثل طب الأسنان وجراحة العظام والجراحة وطب العيون وأمراض القلب وغيرها.
يجب أن يسمح أداء التقييم باستنتاج النشاط الحيوي للمادة الحيوية في الأنسجة الحية إلى جانب السمية الخلوية. في أقرب وقت ممكن من بداية التجربة ، استخدم ملعقة لتحميل المادة الحيوية الطازجة في قوالب PVC ، واترك المادة ثابتة لفترة زمنية مناسبة في درجة حرارة الغرفة. عندما تصلب المادة, قم بإزالة الكريات من القوالب, وضعها في وعاء بحجم مناسب.
ثم تعقيم الكريات تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة لكل جانب. لاستخراج المواد الحيوية من الكريات, ضع الكريات المعقمة في أنبوب 50 ملليلتر, وأضف وسيط زراعة الخلايا المناسب إلى الكريات. ضع الأنابيب على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، استخدم وسيطا جديدا لتخفيف المستخلص إلى الأحجام المناسبة من الاهتمام. لتقييم مورفولوجيا الخلية استجابة للتعرض للمواد الحيوية ، استخدم ملاقط معقمة لوضع غطاء زجاجي معقم بحجم مناسب في كل بئر من صفيحة متعددة الآبار. أضف الخلايا إلى كل غطاء بتركيز مناسب ، وضعها في الحاضنة طوال الليل.
أضف الحجم المناسب من تخفيف المستخلص الذي يهم كل بئر ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لفترة الحضانة المناسبة. في نهاية الحضانة ، قم بشفط المادة الطافية من كل بئر للسماح لأغطية الأغطية بالجفاف في درجة حرارة الغرفة. عندما تجف العينات ، قم بتغطية كل غطاء بحجم كاف من محلول May-Grunwald لمدة ثلاث دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة الصبغة ، اغسل أغطية الغطاء بكمية مناسبة من الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة ، تليها حضانة لمدة 15 دقيقة في حجم كاف من محلول Giemsa. في نهاية الحضانة ، اغسل أغطية الأغطية في الماء الجاري ، وصور الخلايا بواسطة المجهر الضوئي. لتقييم وظيفة الخلية عن طريق تقييم تعبير البروتين بعد التعرض للمادة الحيوية ذات الأهمية كما هو موضح ، اغسل كل بئر من الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني قبل تثبيت الخلايا بنسبة 3.7٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتخلل الخلايا بنسبة 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. في نهاية التخلل ، قم بحظر البيروكسيديز بنسبة 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في PBS لمدة خمس دقائق ، متبوعا بغسلتين باستخدام PBS. بعد الغسيل الثاني ، اغسل الخلايا مرتين بنسبة 0.5٪ BSA قبل سد الارتباط غير المحدد بنسبة 2٪ BSA لمدة 45 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 0.5٪ BSA قبل احتضان الخلايا بجسم مضاد أولي ضد البروتين محل الاهتمام لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها خمس غسلات مع 0.5٪ BSA طازجة. بعد الغسلة الأخيرة ، احتضن الخلايا بالجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها خمس غسلات لمدة دقيقة واحدة في 0.5٪ BSA. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الخلايا بركيزة مناسبة وخليط كروموجين عند 20 ميكرولتر من الكروموجين لكل ملليلتر من تركيزات الركيزة لمدة 25 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، اغسل الثقافات مرتين بنسبة 0.5٪ BSA في PBS ، وقم بتلطيخ الخلايا بالهيماتوكسيلين لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا المضادة لمدة خمس دقائق ب 0.037 مول لكل لتر من الأمونيا. ثم اغسلها لمدة خمس دقائق بالماء المقطر لإزالة أي صبغة زائدة ، واستخدم الجلسرين لتركيب أغطية الأغطية على الشرائح.
لتقييم تكوين الرواسب المعدنية داخل مزارع الخلايا المعالجة بالمستخلص ، اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني قبل تثبيت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتلطيخ الخلايا بحجم مناسب من محلول تلطيخ أحمر أليزارين لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني حتى تتم إزالة الصبغة الزائدة تماما ، وقم بتصوير الخلايا بواسطة الفحص المجهري الضوئي.
ثم أضف محلول الاستخراج إلى كل بئر لمدة 40 دقيقة حضانة مع التقليب في درجة حرارة الغرفة ، وقم بقياس الامتصاص في كل بئر على مقياس الطيف الضوئي بطول موجة 490 نانومتر. يمكن استخدام مقايسة MTT للحصول على نظرة عامة على السمية الخلوية للمواد بطريقة سريعة ومباشرة كما تم قياسها من خلال آثارها على النشاط الأيضي. تسمح تحليلات صلاحية الخلية أيضا بتقييم السمية الخلوية للمادة ذات الأهمية ، حيث أن المواد ذات السمية الخلوية العالية تحفز نسبة أعلى من موت الخلايا بنفس التركيز.
تعتبر التخفيضات التي تزيد عن 30٪ أمرا بالغ الأهمية ، وتحدد المواد على أنها معرضة لخطر انخفاض التوافق الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، تتميز المزيد من المواد السامة للخلايا بانخفاض حاد في صلاحية الخلية وموت الخلايا المبرمج المتأخر ونخر موت الخلايا ، في حين أن المواد الأقل سمية للخلايا تحفز موت الخلايا بشكل أقل وصورة موت الخلايا المبرمج المتأخرة والمتأخرة. يكمل التقييم المورفولوجي تقييم صلاحية الخلية ، حيث يمكن أن تشير التغييرات في مورفولوجيا الخلية إلى ملف تعريف موت الخلايا المبرمج أو الميت ، بالإضافة إلى الكشف عن وجود جزيئات المواد.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة آثار المواد ذات الأهمية على التعبير عن البروتين بشكل مستقل عن التأثيرات على الجدوى. على سبيل المثال ، في هذا التحليل ، تسببت إحدى المواد في زيادة في التعبير عن البروتين ، بينما عززت الأخرى انخفاضا كبيرا. في كلتا الحالتين ، أثر تركيز المستخلصات بشكل مباشر على تعبير البروتين.
في إعداد المستخلصات ، تعد نسب سطح المواد الحيوية المناسبة إلى الحجم المتوسط أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تعقيم العينات باستخدام طرق لا تغير خصائصها. تفاصيل أخرى يجب تذكرها هي مقتطفات الأس الهيدروجيني ، والتي يجب تسجيلها دون تعديل.
إذا لزم الأمر، قم بإجراء عناصر تحكم إضافية. يمكن استخدام مقتطفات المواد الحيوية لدراسات الكيمياء والكيمياء الحيوية ، وكذلك للعديد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى. توفر النتائج التي تم الحصول عليها الأساس لاختبار التوافق الحيوي في الجسم الحي في المستقبل.
تقييم السمية الخلوية أمر بالغ الأهمية لتطوير أي مادة مخصصة للاستخدام الطبي. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نهجا منهجيا وشاملا لتقييم المواد الحيوية الجديدة أو التطبيقات الجديدة للآخرين الموجودين بالفعل في مجالات طبية مختلفة.
