获取细胞毒性和细胞对生物材料的反应

随着用于医疗应用的新材料的爆炸式增长，应系统地进行初步筛选，因此该协议可以成为旨在开发和表征新型生物材料的研究人员的基本工具。该方法允许定量和定性评估生物材料和药物制剂（固体和液体）的细胞毒性和生物活性。细胞暴露后，可以进行几种互补测定。

生物材料细胞毒性的建立可能对临床实践产生相关意义。例如，这些知识可以使临床医生能够为特定患者或病症选择最合适的生物材料。该协议允许在不同领域表征新型生物材料，例如牙科，骨科，外科，眼科，心脏病学等。

评估性能应允许得出除细胞毒性外活组织中生物材料生物活性的结论。尽可能接近实验开始，用刮刀将新鲜制备的生物材料装入PVC模具中，并让材料在室温下凝固适当的时间。材料凝固后，从模具中取出颗粒，并将它们放入适当大小的容器中。

然后在紫外线灯下对颗粒进行每侧20分钟的消毒。为了从沉淀中提取生物材料，将灭菌的颗粒放入50毫升管中，并向颗粒中加入适当的细胞培养基。将试管置于 37 摄氏度下 24 小时。

第二天，使用新鲜培养基将提取物稀释至适当的感兴趣体积。为了评估响应生物材料暴露的细胞形态，请使用无菌镊子将适当大小的无菌玻璃盖玻片放入多孔板的每个孔中。以足够的浓度将细胞添加到每个盖玻片中，并置于培养箱中过夜。

向每个孔中加入适当体积的感兴趣提取物稀释液，并将细胞返回到细胞培养箱进行适当的孵育期。在孵育结束时，从每个孔中吸出上清液，以使盖玻片在室温下干燥。样品干燥后，用足够体积的May-Grunwald溶液覆盖每个盖玻片，在室温下孵育三分钟。

去除染料后，用适量的蒸馏水洗涤盖玻片一分钟，然后在足够体积的吉姆萨溶液中孵育15分钟。在孵育结束时，用流水清洗盖玻片，并通过光学显微镜对细胞进行成像。为了在暴露于感兴趣的生物材料后通过蛋白质表达评估来评估细胞功能，如图所示，在室温下用3.7%多聚甲醛固定细胞30分钟之前，用PBS洗涤每个细胞孔。

在孵育结束时，用PBS洗涤细胞两次，并在PBS中用0.5%Triton透化细胞15分钟。在渗透结束时，用PBS中的0.3%过氧化氢封闭过氧化物酶五分钟，然后用PBS洗涤两次。第二次洗涤后，用0.5%BSA洗涤细胞两次，然后用2%BSA封闭非特异性结合45分钟。

在孵育结束时，用0.5%BSA洗涤细胞一次，然后将细胞与针对目标蛋白质的一抗在室温下孵育60分钟，然后用新鲜的0.5%BSA洗涤五次。最后一次洗涤后，将细胞与适当的目标二抗在室温下孵育90分钟，然后在0.5%BSA中洗涤五次一分钟。最后一次洗涤后，将细胞与适当的底物和色原混合物以每毫升底物浓度20微升的显色剂孵育25分钟。

在孵育结束时，在PBS中用0.5%BSA洗涤培养物两次，并用苏木精复染细胞15分钟。用每升氨水 0.037 摩尔洗涤复染细胞五分钟。然后用蒸馏水清洗五分钟以去除多余的染料，并使用甘油将盖玻片安装到载玻片上。

为了评估提取物处理过的细胞培养物中矿化沉积物的形成，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟之前，用PBS洗涤每个孔三次。最后一次洗涤后，在黑暗中用适当体积的茜素红染色溶液在37摄氏度下染色细胞20分钟。在孵育结束时，用PBS洗涤孔，直到多余的染料完全去除，并通过光学显微镜对细胞进行成像。

然后将提取溶液加入每个孔中，在室温下搅拌孵育40分钟，并在490纳米波长的分光光度计上测量每个孔中的吸光度。MTT测定可用于以快速直接的方式获得材料的细胞毒性概述，通过其对代谢活性的影响来衡量。细胞活力分析还可以评估目标材料的细胞毒性，因为具有较高细胞毒性的材料在相同浓度下诱导更高百分比的细胞死亡。

减少30%以上被认为是关键的，并将材料定义为具有低生物相容性的风险。此外，细胞毒性较高的材料的特征是细胞活力的急剧下降以及晚期细胞凋亡和坏死细胞死亡特征，而细胞毒性较低的材料诱导较少的细胞死亡以及更多的凋亡和晚期凋亡特征。形态学评估是对细胞活力评估的补充，因为细胞形态的变化可以表明细胞凋亡或坏死特征，并揭示材料颗粒的存在。

此外，可以观察到目标材料对蛋白质表达的影响，而与对活力的影响无关。例如，在该分析中，一种材料诱导蛋白质表达增加，而另一种材料促进显着降低。在这两种情况下，提取物的浓度都直接影响蛋白质表达。

在提取物制备中，适当的生物材料表面与中等体积比至关重要。此外，必须使用不改变其性质的方法对样品进行灭菌。要记住的另一个细节是提取物的pH值，应无需调整即可注册。

如果需要，请执行其他控件。生物材料提取物可用于化学和生物化学研究，以及其他几种分子生物学技术。所得结果为今后体内生物相容性测试提供了依据。

细胞毒性评估对于开发任何用于医疗用途的材料至关重要。因此，该协议为评估新生物材料或其他已经存在于不同医学领域的新应用提供了一种系统和全面的方法。