Com a explosão de novos materiais para aplicações médicas, a triagem inicial deve ser feita sistematicamente, para que este protocolo possa ser uma ferramenta fundamental para pesquisadores que almejam desenvolver e caracterizar novos biomateriais. A metodologia permite a avaliação quantitativa e qualitativa da citotoxicidade e bioatividade de biomateriais e formulações farmacêuticas, tanto sólidas quanto líquidas. Após a exposição celular, vários ensaios complementares podem ser realizados.
O estabelecimento da citotoxicidade dos biomateriais pode ter implicações relevantes para a prática clínica. Por exemplo, esse conhecimento pode capacitar o clínico a escolher o biomaterial mais apropriado para um paciente ou condição específica. Este protocolo permite a caracterização de novos biomateriais em diferentes áreas como odontologia, ortopedia, cirurgia, oftalmologia, cardiologia, entre outras.
O desempenho da avaliação deve permitir concluir sobre a bioatividade do biomaterial em tecidos vivos, além da citotoxicidade. O mais próximo possível do início do experimento, use uma espátula para carregar o biomaterial recém-preparado nos moldes de PVC e deixe o material definido para a quantidade adequada de tempo à temperatura ambiente. Quando o material tiver solidificado, retire os pellets dos moldes e coloque-os em um recipiente de tamanho adequado.
Em seguida, esterilize os pellets sob uma lâmpada de luz ultravioleta por 20 minutos por lado. Para extrair os biomateriais dos pellets, coloque os pellets esterilizados em um tubo de 50 mililitros e adicione o meio de cultura celular apropriado aos pellets. Coloque os tubos a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, utilizar meio fresco para diluir o extrato nos volumes apropriados de interesse. Para avaliar a morfologia celular em resposta à exposição ao biomaterial, use pinças estéreis para colocar uma tampa de vidro estéril de tamanho adequado em cada poço de uma placa de vários poços. Adicione células a cada lamínula em uma concentração adequada e coloque na incubadora durante a noite.
Adicionar o volume apropriado da diluição do extrato de interesse a cada poço e retornar as células à incubadora de cultura celular para o período de incubação apropriado. Ao final da incubação, aspirar o sobrenadante de cada poço para permitir que as lamínulas sequem à temperatura ambiente. Quando as amostras tiverem secado, cubra cada lamínula com um volume suficiente de solução de May-Grunwald para uma incubação de três minutos à temperatura ambiente.
Depois de remover o corante, lave as lamínulas com um volume adequado de água destilada durante um minuto, seguido de uma incubação de 15 minutos num volume suficiente de solução de Giemsa. Ao final da incubação, lave as lamínulas em água corrente e faça a imagem das células por microscopia de luz. Para avaliar a função celular pela avaliação da expressão proteica após exposição ao biomaterial de interesse, conforme demonstrado, lavar cada poço de células com PBS antes de fixar as células com paraformaldeído a 3,7% por 30 minutos à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, lavar as células duas vezes com PBS e permeabilizar as células com Triton 0,5% em PBS por 15 minutos. Ao final da permeação, bloquear a peroxidase com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PBS por cinco minutos, seguido de duas lavagens com PBS. Após a segunda lavagem, lavar as células duas vezes com BSA a 0,5% antes de bloquear a ligação inespecífica com BSA a 2% por 45 minutos.
Ao final da incubação, lavar as células uma vez com BSA 0,5% antes de incubar as células com um anticorpo primário contra a proteína de interesse por 60 minutos à temperatura ambiente, seguido de cinco lavagens com BSA fresco a 0,5%. Após a última lavagem, incubar as células com o anticorpo secundário apropriado de interesse por 90 minutos à temperatura ambiente, seguido de cinco lavagens de um minuto em BSA 0,5%. Após a última lavagem, incubar as células com substrato apropriado e mistura de cromógenos a 20 microlitros de cromógeno por mililitro de substrato por 25 minutos.
Ao final da incubação, lavar as culturas duas vezes com BSC a 0,5% em PBS e contracorar as células com hematoxilina por 15 minutos. Lave as células contracoradas por cinco minutos com 0,037 moles por litro de amônia. Em seguida, lave por cinco minutos com água destilada para remover qualquer excesso de corante e use glicerol para montar as tampas em lâminas.
Para avaliar a formação de depósitos mineralizados dentro das culturas celulares tratadas com extrato, lavar cada poço três vezes com PBS antes de fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a última lavagem, manchar as células com um volume apropriado de solução corante vermelha de alizarina por 20 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Ao final da incubação, lavar os poços com PBS até que o excesso de corante tenha sido completamente removido e obter imagens das células por microscopia de luz.
Em seguida, adicione a solução de extração a cada poço por uma incubação de 40 minutos com agitação à temperatura ambiente e meça a absorbância em cada poço em um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 490 nanômetros. Um ensaio de MTT pode ser usado para obter uma visão geral da citotoxicidade dos materiais de forma rápida e direta, medida por seus efeitos sobre a atividade metabólica. As análises de viabilidade celular também permitem avaliar a citotoxicidade de um material de interesse, uma vez que materiais com maior citotoxicidade induzem maior porcentagem de morte celular na mesma concentração.
Reduções de mais de 30% são consideradas críticas e definem os materiais como em risco de baixa biocompatibilidade. Além disso, mais materiais citotóxicos são caracterizados por uma diminuição acentuada da viabilidade celular e um perfil de morte celular de apoptose e necrose tardias, enquanto menos materiais citotóxicos induzem menos morte celular e um perfil apoptótico e apoptótico tardio. A avaliação morfológica complementa a avaliação da viabilidade celular, pois alterações na morfologia celular podem indicar um perfil apoptótico ou necrótico, bem como revelar a presença de partículas de material.
Além disso, os efeitos de materiais de interesse sobre a expressão proteica podem ser observados independentemente dos efeitos sobre a viabilidade. Por exemplo, nesta análise, um material induziu um aumento na expressão proteica, enquanto o outro promoveu uma diminuição significativa. Em ambos os casos, a concentração dos extratos influenciou diretamente a expressão proteica.
Na preparação dos extratos, a relação superficial e média volumétrica do biomaterial é crítica. Além disso, as amostras devem ser esterilizadas por métodos que não alterem suas propriedades. Outro detalhe a ser lembrado são os extratos de pH, que devem ser registrados sem ajuste.
Se necessário, execute controles adicionais. Os extratos de biomateriais podem ser utilizados para estudos de química e bioquímica, bem como para diversas outras técnicas de biologia molecular. Os resultados obtidos fornecem a base para futuros testes de biocompatibilidade in vivo.
A avaliação da citotoxicidade é crucial para o desenvolvimento de qualquer material destinado a uso médico. Portanto, este protocolo fornece uma abordagem sistemática e abrangente para avaliar novos biomateriais ou novas aplicações de outros já existentes em diferentes áreas médicas.
