Con la explosión de nuevos materiales para aplicaciones médicas, la selección inicial debe hacerse de forma sistemática, por lo que este protocolo puede ser una herramienta fundamental para los investigadores que buscan desarrollar y caracterizar nuevos biomateriales. La metodología permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la citotoxicidad y bioactividad de biomateriales y formulaciones farmacéuticas, tanto sólidas como líquidas. Después de la exposición celular, se pueden realizar varios ensayos complementarios.
El establecimiento de la citotoxicidad de los biomateriales puede tener implicaciones relevantes para la práctica clínica. Por ejemplo, este conocimiento puede capacitar al médico para elegir el biomaterial más apropiado para un paciente o condición específica. Este protocolo permite la caracterización de nuevos biomateriales en diferentes áreas como odontología, ortopedia, cirugía, oftalmología, cardiología, entre otras.
El rendimiento de la evaluación debe permitir concluir sobre la bioactividad del biomaterial en tejidos vivos además de la citotoxicidad. Lo más cerca posible del comienzo del experimento, use una espátula para cargar el biomaterial recién preparado en los moldes de PVC y deje que el material se asiente durante el tiempo apropiado a temperatura ambiente. Cuando el material se haya solidificado, retire los gránulos de los moldes y colóquelos en un recipiente del tamaño adecuado.
Luego esterilice los gránulos bajo una lámpara de luz ultravioleta durante 20 minutos por lado. Para extraer los biomateriales de los pellets, coloque los pellets esterilizados en un tubo de 50 mililitros y agregue el medio de cultivo celular apropiado a los pellets. Coloque los tubos a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, use un medio fresco para diluir el extracto a los volúmenes apropiados de interés. Para evaluar la morfología celular en respuesta a la exposición a biomateriales, use pinzas estériles para colocar un cubreobjetos de vidrio estéril del tamaño adecuado en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos. Agregue células a cada cubreobjetos a una concentración adecuada y colóquelas en la incubadora durante la noche.
Agregue el volumen apropiado de la dilución del extracto de interés a cada pocillo y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante el período de incubación apropiado. Al final de la incubación, aspire el sobrenadante de cada pocillo para permitir que los cubreobjetos se sequen a temperatura ambiente. Cuando las muestras se hayan secado, cubrir cada cubreobjetos con un volumen suficiente de solución de May-Grunwald para una incubación de tres minutos a temperatura ambiente.
Después de retirar el tinte, lavar los cubreobjetos con un volumen adecuado de agua destilada durante un minuto, seguido de una incubación de 15 minutos en un volumen suficiente de solución de Giemsa. Al final de la incubación, lave los cubreobjetos en agua corriente y obtenga imágenes de las células mediante microscopía óptica. Para evaluar la función celular mediante la evaluación de la expresión de proteínas después de la exposición al biomaterial de interés como se demuestra, lave cada pocillo de células con PBS antes de fijar las células con paraformaldehído al 3,7% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lavar las células dos veces con PBS y permeabilizar las células con 0,5% Tritón en PBS durante 15 minutos. Al final de la permeación, bloquee la peroxidasa con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS durante cinco minutos, seguido de dos lavados con PBS. Después del segundo lavado, lave las células dos veces con BSA al 0,5% antes de bloquear la unión no específica con BSA al 2% durante 45 minutos.
Al final de la incubación, lavar las células una vez con BSA al 0,5% antes de incubar las células con un anticuerpo primario contra la proteína de interés durante 60 minutos a temperatura ambiente, seguido de cinco lavados con BSA fresca al 0,5%. Después del último lavado, incubar las células con el anticuerpo secundario apropiado de interés durante 90 minutos a temperatura ambiente, seguido de cinco lavados de un minuto en BSA al 0,5%. Después del último lavado, incubar las células con un sustrato apropiado y una mezcla de cromógenos a 20 microlitros de cromógeno por mililitro de concentraciones de sustrato durante 25 minutos.
Al final de la incubación, lavar los cultivos dos veces con BSA al 0,5% en PBS y contrateñir las células con hematoxilina durante 15 minutos. Lave las celdas contrateñidas durante cinco minutos con 0.037 moles por litro de amoníaco. Luego lave durante cinco minutos con agua destilada para eliminar cualquier exceso de tinte y use glicerol para montar los cubreobjetos en portaobjetos.
Para evaluar la formación de depósitos mineralizados dentro de los cultivos celulares tratados con extracto, lavar cada pocillo tres veces con PBS antes de fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del último lavado, tiñe las células con un volumen apropiado de solución de tinción de rojo alizarina durante 20 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Al final de la incubación, lave los pocillos con PBS hasta que el exceso de tinte se haya eliminado por completo y obtenga imágenes de las células mediante microscopía óptica.
Luego agregue la solución de extracción a cada pozo durante una incubación de 40 minutos con agitación a temperatura ambiente, y mida la absorbancia en cada pocillo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nanómetros. Se puede utilizar un ensayo MTT para obtener una visión general de la citotoxicidad de los materiales de una manera rápida y directa, medida por sus efectos sobre la actividad metabólica. Los análisis de viabilidad celular también permiten evaluar la citotoxicidad de un material de interés, ya que los materiales con mayor citotoxicidad inducen un mayor porcentaje de muerte celular a la misma concentración.
Las reducciones de más del 30% se consideran críticas y definen los materiales como en riesgo de baja biocompatibilidad. Además, los materiales más citotóxicos se caracterizan por una disminución acentuada de la viabilidad celular y un perfil de muerte celular de apoptosis y necrosis tardía, mientras que los materiales menos citotóxicos inducen menos muerte celular y un perfil más apoptótico y apoptótico tardío. La evaluación morfológica complementa la evaluación de la viabilidad celular, ya que los cambios en la morfología celular pueden indicar un perfil apoptótico o necrótico, así como revelar la presencia de partículas materiales.
Además, los efectos de los materiales de interés en la expresión de proteínas se pueden observar independientemente de los efectos sobre la viabilidad. Por ejemplo, en este análisis, un material indujo un aumento en la expresión de proteínas, mientras que el otro promovió una disminución significativa. En ambos casos, la concentración de los extractos influyó directamente en la expresión proteica.
En la preparación de extractos, las proporciones apropiadas de superficie de biomaterial a volumen medio son críticas. Además, las muestras deben esterilizarse utilizando métodos que no alteren sus propiedades. Otro detalle a recordar son los extractos de pH, que deben registrarse sin ajuste.
Si es necesario, realice controles adicionales. Los extractos de biomateriales se pueden utilizar para estudios de química y bioquímica, así como para varias otras técnicas de biología molecular. Los resultados obtenidos proporcionan la base para futuras pruebas de biocompatibilidad in vivo.
La evaluación de la citotoxicidad es crucial para el desarrollo de cualquier material destinado a uso médico. Por lo tanto, este protocolo proporciona un enfoque sistemático e integral para evaluar nuevos biomateriales o nuevas aplicaciones de otros ya existentes en diferentes áreas médicas.
