Este protocolo permite que os usuários estudem como o sistema imunológico produz anticorpos para patógenos ou micróbios commensais. Além disso, caminhos moleculares que regulam a diversificação genética da imunoglobulina podem ser estudados usando camundongos geneticamente modificados. O protocolo usa uma combinação de técnicas comuns de biologia molecular, incluindo sequenciamento PCR e Sanger e não requer classificação celular única ou sequenciamento profundo.
As Manchas do Peyer podem ser facilmente confundidas com o tecido adiposo circundante. Assim, a demonstração visual deste método pode ser útil para aqueles que não estão familiarizados com este órgão identificar sua localização e observar sua dissecação. Comece colocando o rato na almofada de dissecção com o abdômen exposto.
Pulverize generosamente o corpo do mouse com 70% de etanol antes de fazer qualquer incisão para esterilizar a área de dissecção. Faça uma incisão na pele através do abdômen e puxe simultaneamente em ambos os lados da incisão com dedos ou fórceps. Em seguida, corte a cavidade peritoneal com uma tesoura para expor os órgãos internos.
Localize o intestino delgado e remova-o cortando abaixo do estômago e acima do ceco. Remova qualquer tecido conjuntivo e gordura que ligue as dobras do intestino delgado. Examine a superfície externa do intestino delgado para as Manchas do Peyer, que são pequenas estruturas em forma oval que aparecem brancas abaixo de uma fina camada de células epiteliais translúcidas.
Extirpa cuidadosamente todas as Manchas de Peyer visíveis com uma tesoura e colete-as em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão FACS no gelo. Se o tecido coletado afundar no fundo do tubo, é de fato um pedaço de Peyer e não tecido adiposo. Coloque um filtro de 40 mímetros em um prato de seis poços com um mililitro de tampão FACS frio, em seguida, despeje as Manchas do Peyer do tubo de 1,5 mililitro sobre o filtro.
Use a extremidade plana do êmbolo de uma seringa de um mililitro como um pilão para esmagar as manchas do Peyer no filtro até que apenas o tecido conjuntivo permaneça. Lave o filtro e o êmbolo com um mililitro de tampão FACS frio para liberar as células no prato de seis poços. Colete as células e filtre-as através de um tubo FACS de 40 micrômetros.
Em seguida, lave a tampa do coador com um mililitro de tampão FACS frio. Pelotar as células por centrifificá-las a 600G a 4 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, decantar o supernaspe e resuspensar as células em 0,4 mililitros de tampão FACS frio com bloco FC.
Incubar amostras no gelo por 15 minutos e depois lavar e pellet as células. Para colorar as células B do centro germinal ou GCBCs, resuspenque as células do tipo selvagem em 80 microliters de tampão FACS. Remova 10 microliters de células do tipo selvagem Peyer's Patches para cada controle de coloração.
Deixando 40 microliters da suspensão celular para as amostras experimentais. Alternativamente, use contas de compensação para os controles de coloração. Colorique cada uma das amostras experimentais em 500 microliters de tampão FACS frio com 2,5 microliters de PNA Biotin por 15 minutos no gelo.
Em seguida, lave as células de manchas PNA. Colora cada amostra com 500 microliters de coquetel GCBC no escuro e no gelo por 15 minutos, certificando-se de que as células estão totalmente resuspendidas no coquetel. Para preparar os controles de coloração único para a matriz de compensação, colorir as células em 500 microliters de tampão FACS frio usando a diluição especificada no texto.
Incubar os controles de coloração no escuro no gelo por 15 minutos. Adicione dois mililitros de tampão FACS frio para lavar todas as amostras e controles da mancha. Pelota as células e descarte o supernascer antes de reutilizar as células em um volume final de 500 microliters de tampão FACS frio para funcionar no cítmetro.
Em seguida, use um classificador de células para coletar as células altas PNA positivas B220 de cada amostra experimental manchada. Para extrair o DNA das células B do centro germinal ou GCBCs, resuspenque as células em 500 microliters de tampão de extração de DNA e cinco microliters de Proteinase K.Então precipile o DNA com 500 microliters de isopropanol e um microlitro de glicogênio. E misture bem o tubo invertendo-o cinco ou seis vezes.
Depois de incubar a amostra por 10 minutos à temperatura ambiente, centrifuá-la por 15 minutos a 21.000G e 25 graus Celsius. Descarte o supernatante e lave a pelota de DNA com um mililitro de 70% de etanol. Centrifugar o DNA a 21.000G por 10 minutos, depois remova o etanol e seque a pelota por cinco a 10 minutos.
Resuspend o DNA em 30 microliters de tampão de TE e incuba-lo durante a noite a 56 graus Celsius. Execute pcr aninhado para o JH4 Intron. Normalizando a quantidade total de DNA genômico usado no primeiro PCR para a amostra menos concentrada.
Depois de executar os produtos PCR em um gel, extirpar o amplicon e purificá-lo com um kit de extração de gel. Em seguida, litigar o amplicon em um plasmídeo e transformar células bacterianas eletroeprotélicas com dois microliters da reação de ligadura. Eletroporar as células a 1,65 kilovolts e resgatá-las em 600 microliters de mídia SOC por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora a 225 RPM.
Placa 100 microliters da bactéria transformada em placas de ágar LB suplementadas com ampicillina e incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Sequencie o DNA de plasma das colônias bacterianas e alinhe as sequências obtidas para cada PCR contra a sequência de referência JH4 Intron usando um software Ômega Clustal. Identifique diferenças da sequência de referência como mutações.
As células do centro B germinal foram identificadas pela medição da expressão do receptor B220 e vinculação de aglutinina de amendoim. As manchas de Peyer do tipo selvagem continham uma média de 4 milhões de células por rato. E aproximadamente 8% das células eram B220 positivas PNA alta, que é metade do observado em camundongos knockout AID.
Das 105 sequências únicas obtidas do tipo selvagem células do centro B germinal, um total de 226 mutações foram encontradas. A análise do espectro de mutação mostrou uma série de transições e versões trans a uma taxa de quatro vezes 10 para a terceira mutação negativa por par de base. Apenas duas mutações foram identificadas em 113 sequências de nocautes aid.
Além disso, cada produto JH4 PCR de células germinal de tipo selvagem do centro B continha de uma a 25 mutações com múltiplas mutações frequentemente encontradas em uma sequência. Ao tentar este protocolo, lembre-se de manter as células no gelo para preservar a viabilidade celular. Depois de colori-los, mantenha as células no escuro para evitar fotobleaching os fluoroforos.
Para correlacionar a hipermutação somática com a maturação da afinidade de anticorpos, recomendamos o uso de um protocolo de imunização e ensaio para titulações de anticorpos específicas de antígeno e mutações da região V.
