このプロトコルは、免疫系が病原体またはコメンザル微生物に対する抗体を産生する方法を研究することを可能にする。また、免疫グロブリン遺伝子の多様化を調節する分子経路は、遺伝子操作マウスを用いて研究することができる。このプロトコルは、PCRとサンガーシーケンシングを含む一般的な分子生物学技術の組み合わせを使用し、単一細胞のソートや深いシーケンシングを必要としません。
ペイヤーのパッチは周囲の脂肪組織と容易に混同することができる。したがって、この方法の視覚的なデモンストレーションは、この器官に精通していない人がその位置を特定し、その解剖を観察するのに役立つかもしれません。まず、腹部を露出した状態で、解剖パッドの上にマウスを置くことから始めます。
切開を行う前に、マウスの本体に70%エタノールを惜しみなくスプレーして、解剖領域を殺菌します。腹部を横切って皮膚に切開し、指や鉗子で切開の両側を同時に引っ張ります。その後、腹膜腔をはさみで切断し、内臓を露出させます。
小腸を見つけ、胃の下と盲腸の上に切断することによってそれを取り除きます.小腸のひだを結ぶ結合組織と脂肪を取り除きます。半透明の上皮細胞の薄い層の下に白く見える小さな楕円形の構造であるペイヤーのパッチについては、小腸の外表面を調べます。
目に見えるペイアーのパッチをはさみで慎重に切除し、氷の上に1ミリリットルのFACSバッファーを含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に集める。採取した組織がチューブの底に沈む場合、それは実際にはペイヤーのパッチであり、脂肪組織ではありません。冷たいFACSバッファーの1ミリリットルと6ウェル皿に40マイクロメーターフィルターを置き、その後、フィルタに1.5ミリリットルチューブからペイアーのパッチを注ぎます。
1ミリリットルのシリンジからのプランジャーの平らな端を害虫として使用し、結合組織だけが残るまでフィルター上のペイアーのパッチを押しつぶします。フィルターとプランジャーを冷たいFACSバッファーの1ミリリットルで洗い、細胞を6つのウェルディッシュに放出します。細胞を収集し、40マイクロメートルストレーナーキャップFACSチューブを介してそれらをフィルタリングします。
その後、冷たいFACSバッファーの1ミリリットルでストレーナーキャップを洗います。細胞を摂氏4度で600Gで5分間遠心してペレット状にする。その後、上清をデカントし、FCブロックを有する冷たいFACSバッファーの0.4ミリリットルで細胞を再懸濁する。
サンプルを氷の上で15分間インキュベートし、細胞を洗浄してペレット化します。胚中心B細胞またはGCBCを染色するには、野生型細胞を80マイクロリットルのFACSバッファーに再懸濁させる。各染色コントロール用の野生型ペイアーのパッチから10マイクロリットルの細胞を取り除きます。
実験サンプル用の細胞懸濁液の40マイクロリットルを残す。または、染色コントロールに補償ビーズを使用します。2.5マイクロリットルのPNAビオチンを氷上で15分間、500マイクロリットルの冷たいFACSバッファーに各実験サンプルを染色します。
その後、PNA染色細胞を洗浄します。各サンプルに500マイクロリットルのGCBCカクテルを暗黒と氷の上で15分間染色し、細胞がカクテル中に完全に再懸濁されることを確認します。補償マトリックス用の単一の染色コントロールを準備するには、テキストで指定された希釈を使用して、500マイクロリットルのコールドFACSバッファーで細胞を染色します。
氷の上の暗闇の中で15分間染色制御をインキュベートします。すべての汚れのサンプルおよび制御を洗うために冷たいFACSバッファーの2ミリリットルを加える。細胞をペレットにし、細胞を再懸濁して500マイクロリットルの冷たいFACSバッファーを細胞に再懸濁させて、細胞計上で実行します。
次いで、細胞選別機を用いて、各染色実験試料からB220陽性PNA高細胞を採取する。胚中心B細胞またはGCBCからDNAを抽出するには、500マイクロリットルのDNA抽出バッファーおよび5マイクロリットルのプロテインナーゼK.で細胞を再懸濁し、500マイクロリットルのイソプロパノールと1マイクロリットルのグリコーゲンでDNAを沈殿させる。そして、チューブを5〜6回反転して完全に混ぜます。
室温で10分間サンプルをインキュベートした後、21、000G、摂氏25度で15分間遠心分離します。上清を捨て、70%エタノールの1ミリリットルでDNAペレットを洗浄します。21,000GでDNAを遠心分離し、エタノールを取り除き、ペレットを5~10分間空気乾燥します。
30マイクロリットルのTEバッファーでDNAを再懸濁し、摂氏56度で一晩インキュベートする。JH4 イントロンのネスト PCR を実行します。最初のPCRで使用されるゲノムDNAの総量を最も濃縮されていないサンプルに正規化する。
PCR製品をゲルで実行した後、アンプリコンを切除し、ゲル抽出キットで精製します。次いで、アンプリコンをプラスミドに塗布し、2マイクロリットルのライゲーション反応で電解管性細菌細胞を変換します。細胞を1.65キロボルトで電気ポポレートし、225 RPMの揺れインキュベーターで摂氏37度で1時間、600マイクロリットルのSOC培地で救助します。
変換された細菌のプレート100マイクロリットルをLB寒天プレートにアンピシリンを加え、摂氏37度で一晩インキュベートする。細菌コロニーから血漿DNAを配列し、Clustal Ωソフトウェアを用いて、各PCRについて得られた配列をJH4 Intron参照配列に合わせます。参照シーケンスとの違いを突然変異として識別します。
この胚芽中心B細胞は、B220受容体の発現およびピーナッツ凝集剤の結合を測定することによって同定された。野生型のペイヤーのパッチには、マウスあたり平均400万個の細胞が含まれていました。そして、細胞の約8%は、AIDノックアウトマウスで観察されたその半分であるB220陽性PNA高かった。
野生型の胚芽中心B細胞から得られた105個のユニーク配列のうち、合計226の変異が見つかった。突然変異スペクトルの分析は、1塩基対当たり陰性第3突然変異の4倍の割合で遷移およびトランスバージョンの範囲を示した。113個のAIDノックアウト配列で2つの突然変異のみが同定された。
さらに、野生型の胚芽中心B細胞からの各JH4 PCR産物は、1つの配列に頻繁に見られる複数の突然変異を有する1〜25個の突然変異を含んでいた。このプロトコルを試みる際には、細胞の生存率を維持するために、細胞を氷の上に置いておくことを忘れないでください。細胞を染色した後、蛍光体の光の漂白を防ぐために、細胞を暗闇の中に保管してください。
体細胞ハイパーミューテーションと抗体アフィニティー成熟を相関させるために、免疫プロトコルを用い、抗原特異的抗体力量およびV領域変異についてアッサンジングすることを推奨します。
