Este protocolo permite a los usuarios estudiar cómo el sistema inmunitario produce anticuerpos contra patógenos o microbios proporcionales. Además, las vías moleculares que regulan la diversificación del gen de la inmunoglobulina se pueden estudiar utilizando ratones genéticamente modificados. El protocolo utiliza una combinación de técnicas comunes de biología molecular, incluyendo secuenciación pcr y sanger y no requiere clasificación de células individuales o secuenciación profunda.
Los parches del Peyer se pueden confundir fácilmente con el tejido graso circundante. Así que la demostración visual de este método puede ser útil para aquellos que no están familiarizados con este órgano para identificar su ubicación y observar su disección. Comience colocando el ratón en la almohadilla de disección con el abdomen expuesto.
Rocíe generosamente el cuerpo del ratón con un 70% de etanol antes de hacer cualquier incisión para esterilizar el área de disección. Haga una incisión en la piel a través del abdomen y tire simultáneamente a ambos lados de la incisión con dedos o fórceps. A continuación, corte la cavidad peritoneal con tijeras para exponer los órganos internos.
Localice el intestino delgado y retírelo cortando por debajo del estómago y por encima del cecum. Retire cualquier tejido conectivo y grasa que vincule los pliegues del intestino delgado. Examine la superficie externa del intestino delgado en busca de los parches del Peyer, que son pequeñas estructuras ovaladas que aparecen blancas debajo de una fina capa de células epiteliales translúcidas.
Excita cuidadosamente todos los parches visibles de Peyer con tijeras y recogerlos en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros que contiene un mililitro de amortiguador FACS en hielo. Si el tejido recogido se hunde en la parte inferior del tubo, de hecho es un parche de Peyer y no tejido graso. Coloque un filtro de 40 micro metros en un plato de seis pozos con un mililitro de amortiguador FACS frío, luego vierta los Parches del Peyer desde el tubo de 1,5 mililitros en el filtro.
Utilice el extremo plano del émbolo de una jeringa de un mililitro como peste para aplastar los parches del Peyer en el filtro hasta que sólo quede el tejido conectivo. Lave el filtro y el émbolo con un mililitro de amortiguador FACS frío para liberar las células en el plato de seis pozos. Recoger las células y filtrarlas a través de un tubo FACS de 40 micrómetros.
A continuación, lave la tapa del colador con un mililitro de amortiguador FACS frío. Peletizar las células centrifugando a 600G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, decantar el sobrenadante y volver a abrir las celdas en 0,4 mililitros de búfer FACS frío con bloque FC.
Incuba muestras en hielo durante 15 minutos y luego lava y peletea las células. Para manchar las células B del centro germinal o GCBC, resuspend las células de tipo salvaje en 80 microlitros de búfer FACS. Retire 10 microlitros de células del tipo salvaje Parches de Peyer para cada control de tinción.
Dejando 40 microlitros de la suspensión celular para las muestras experimentales. Como alternativa, utilice cuentas de compensación para los controles de tinción. Mancha cada una de las muestras experimentales en 500 microlitros de amortiguador FACS frío con 2,5 microlitros de PNA Biotin durante 15 minutos en hielo.
A continuación, lave las células de manchas de ANP. Mancha cada muestra con 500 microlitros de cóctel GCBC en la oscuridad y sobre hielo durante 15 minutos, asegurándose de que las células estén completamente resuspendidas en el cóctel. Para preparar los controles de manchas individuales para la matriz de compensación, tiñe las células en 500 microlitros de búfer FACS frío utilizando la dilución especificada en el texto.
Incuba los controles de tinción en la oscuridad sobre hielo durante 15 minutos. Agregue dos mililitros de búfer FACS frío para lavar todas las muestras y controles de manchas. Peletizar las células y desechar el sobrenadante antes de resuspendificar las células en un volumen final de 500 microlitros de búfer FACS frío para funcionar en el cytometer.
A continuación, utilice una ordenadora de celdas para recoger las células altas de PNA positivas B220 de cada muestra experimental manchada. Para extraer el ADN de las células B del centro germinal o GCBC, resuspend las células en 500 microlitros de amortiguador de extracción de ADN y cinco microlitros de Proteinase K.Luego precipitar el ADN con 500 microlitros de isopropanol y un microlitro de glucógeno. Y mezcle bien el tubo invirtiendolo cinco o seis veces.
Después de incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente, centrífula durante 15 minutos a 21.000G y 25 grados Centígrados. Deseche el sobrenadante y lave el pellet de ADN con un mililitro de 70% de etanol. Centrífuga el ADN a 21.000G durante 10 minutos, luego retire el etanol y seque el pellet por aire durante cinco a 10 minutos.
Resuspend el ADN en 30 microlitros de TAMP TE e incubarlo durante la noche a 56 grados Celsius. Realice PCR anidado para el JH4 Intron. Normalizar la cantidad total de ADN genómico utilizado en el primer PCR a la muestra menos concentrada.
Después de ejecutar los productos PCR en un gel, excitar el amplificador y purificarlo con un kit de extracción de gel. A continuación, litigar el amplificador en un plásmido y transformar células bacterianas electro competentes con dos microlitros de la reacción de ligadura. Electropolar las células a 1,65 kilovoltios y rescatarlas en 600 microlitros de medios SOC durante una hora a 37 grados Centígrados en una incubadora temblorosa a 225 RPM.
Placa 100 microlitros de la bacteria transformada en placas de agar LB complementadas con ampicilina e incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius. Secuenciar el ADN plasmático de las colonias bacterianas y alinear las secuencias obtenidas para cada PCR con la secuencia de referencia JH4 Intron utilizando un software Clustal Omega. Identificar las diferencias de la secuencia de referencia como mutaciones.
Las células del centro germinal B se identificaron midiendo la expresión del receptor B220 y la unión de la aglutinina de maní. Los parches de Peyer de tipo salvaje contenían un promedio de 4 millones de células por ratón. Y aproximadamente el 8% de las células eran altas de ANP positivaS B220, que es la mitad de la observada en ratones knockout AID.
De las 105 secuencias únicas obtenidas de células del centro B de germinal salvaje, se encontraron un total de 226 mutaciones. El análisis del espectro mutacional mostró una gama de transiciones y versiones trans a una velocidad de cuatro por 10 a la tercera mutación negativa por par base. Sólo se identificaron dos mutaciones en 113 secuencias de eliminación de AID.
Además, cada producto JH4 PCR de células B de centro germinal de tipo salvaje, contenía de una a 25 mutaciones con múltiples mutaciones encontradas con frecuencia en una secuencia. Al intentar este protocolo, recuerde mantener las células en hielo para preservar la viabilidad celular. Después de manchar las células, mantenga las células en la oscuridad para evitar el fotobleaching de los fluoróforos.
Para correlacionar la hipermutación somática con la maduración de afinidad de anticuerpos, recomendamos utilizar un protocolo de inmunización y ensayos para titers de anticuerpos específicos de antígeno y mutaciones de la región V.
