Ce protocole permet aux utilisateurs d’étudier comment le système immunitaire produit des anticorps contre des agents pathogènes ou des microbes proportionnels. En outre, les voies moléculaires qui régulent la diversification des gènes de l’immunoglobuline peuvent être étudiées à l’aide de souris génétiquement modifiées. Le protocole utilise une combinaison de techniques de biologie moléculaire communes, y compris le séquençage PCR et Sanger et ne nécessite pas de tri cellulaire unique ou de séquençage profond.
Les patchs de Peyer peuvent être facilement confondus avec les tissus adipeux environnants. Ainsi la démonstration visuelle de cette méthode peut être utile pour ceux qui ne sont pas familiers avec cet organe pour identifier son emplacement et observer sa dissection. Commencez par poser la souris sur le tampon de dissection avec l’abdomen exposé.
Vaporiser généreusement le corps de la souris avec 70% d’éthanol avant de faire des incisions pour stériliser la zone de dissection. Faire une incision dans la peau à travers l’abdomen et tirer simultanément des deux côtés de l’incision avec des doigts ou des forceps. Ensuite, couper la cavité péritonéale avec des ciseaux pour exposer les organes internes.
Localiser l’intestin grêle et l’enlever en coupant sous l’estomac et au-dessus du cecum. Enlever tout tissu conjonctif et la graisse reliant les plis de l’intestin grêle ensemble. Examinez la surface externe de l’intestin grêle pour les plaques de Peyer, qui sont de petites structures ovales qui apparaissent blanches sous une mince couche de cellules épithéliales translucides.
Excisez soigneusement toutes les plaques visibles de Peyer avec des ciseaux et recueillez-les dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre contenant un millilitre de tampon FACS sur la glace. Si le tissu recueilli coule au fond du tube, il s’agit en fait d’un patch peyer et non d’un tissu adipeux. Placez un filtre de 40 micromètres dans un plat de six puits avec un millilitre de tampon FACS froid, puis versez les patchs Peyer du tube de 1,5 millilitre sur le filtre.
Utilisez l’extrémité plate du piston à partir d’une seringue d’un millilitre comme pilon pour écraser les plaques de Peyer sur le filtre jusqu’à ce qu’il ne reste que le tissu conjonctif. Lavez le filtre et le piston avec un millilitre de tampon FACS froid pour libérer les cellules dans le plat de six puits. Recueillir les cellules et les filtrer à travers un tube FACS de 40 micromètres.
Lavez ensuite le bouchon de la passoire avec un millilitre de tampon FACS froid. Pelleter les cellules en les centrifugant à 600G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis décanter le supernatant et resuspendre les cellules en 0,4 millilitres de tampon FACS froid avec bloc FC.
Incuber des échantillons sur de la glace pendant 15 minutes, puis laver et pelleter les cellules. Pour tacher les cellules B du centre germinal ou les CCG, résuspendez les cellules sauvages dans 80 microlitres de tampon FACS. Enlevez 10 microlitres de cellules du type sauvage Peyer’s Patches pour chaque contrôle de coloration.
Laissant 40 microlitres de la suspension cellulaire pour les échantillons expérimentaux. Alternativement, utilisez des perles de compensation pour les commandes de coloration. Tacher chacun des échantillons expérimentaux dans 500 microlitres de tampon facs froid avec 2,5 microlitres de biotine PNA pendant 15 minutes sur la glace.
Ensuite, lavez les cellules de tache PNA. Tacher chaque échantillon avec 500 microlitres de cocktail GCBC dans l’obscurité et sur la glace pendant 15 minutes, en s’assurant que les cellules sont entièrement résuspendues dans le cocktail. Pour préparer les commandes de taches unique pour la matrice de compensation, tacher les cellules dans 500 microlitres de tampon FACS froid en utilisant la dilution spécifiée dans le texte.
Incuber les commandes de coloration dans l’obscurité sur la glace pendant 15 minutes. Ajouter deux millilitres de tampon FACS froid pour laver tous les échantillons de taches et les contrôles. Pelleter les cellules et jeter le supernatant avant de réutiliser les cellules dans un volume final de 500 microlitres de tampon FACS froid pour fonctionner sur le cytomètre.
Ensuite, utilisez un trieur cellulaire pour recueillir les cellules élevées B220 positive PNA de chaque échantillon expérimental taché. Pour extraire l’ADN des cellules B du centre germinal ou des CCG, résuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon d’extraction d’ADN et cinq microlitres de Proteinase K.Then précipitez l’ADN avec 500 microlitres d’isopropanol et un microlitre de glycogène. Et bien mélanger le tube en l’inversant cinq ou six fois.
Après avoir incubé l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante, centrifugez-le pendant 15 minutes à 21 000 G et 25 degrés Celsius. Jetez le supernatant et lavez la pastille d’ADN avec un millilitre de 70% d’éthanol. Centrifugez l’ADN à 21 000 G pendant 10 minutes, puis retirez l’éthanol et séchez la pastille pendant 5 à 10 minutes.
Resuspendez l’ADN dans 30 microlitres de tampon TE et incubez-le pendant la nuit à 56 degrés Celsius. Effectuez un PCR imbriqué pour l’Intron JH4. Normaliser la quantité totale d’ADN génomique utilisée dans le premier PCR à l’échantillon le moins concentré.
Après avoir fait fonctionner les produits PCR sur un gel, exciser l’amplicon et le purifier avec un kit d’extraction de gel. Puis plaider l’amplicon en plasmide et transformer les cellules bactériennes électro compétentes avec deux microlitres de la réaction de ligature. Électroporer les cellules à 1,65 kilovolts et les sauver dans 600 microlitres de soc media pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant à 225 RPM.
Plaque 100 microlitres des bactéries transformées sur des plaques d’agar LB complétées par de l’ampicilline et incubent les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Séquencez l’ADN plasmatique des colonies bactériennes et alignez les séquences obtenues pour chaque PCR sur la séquence de référence JH4 Intron à l’aide d’un logiciel Clustal Omega. Identifiez les différences de la séquence de référence comme des mutations.
Les cellules B du centre germinal ont été identifiées en mesurant l’expression du récepteur B220 et la liaison de l’agglutinine d’arachide. Les patchs de Type Sauvage de Peyer contenaient en moyenne 4 millions de cellules par souris. Et environ 8% des cellules étaient B220 positive PNA élevé qui est la moitié de celle observée chez les souris KNOCKOUT AID.
Sur les 105 séquences uniques obtenues à partir de cellules B du centre germinal de type sauvage, un total de 226 mutations ont été trouvées. L’analyse du spectre de mutation a montré une gamme de transitions et de versions trans à un taux de quatre fois 10 aux troisièmes mutations négatives par paire de base. Seulement deux mutations ont été identifiées dans 113 séquences de KO d’AID.
En outre, chaque produit JH4 PCR provenant de cellules germinales du centre B de type sauvage contenait une à 25 mutations avec des mutations multiples fréquemment trouvées sur une séquence. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de garder les cellules sur la glace pour préserver la viabilité cellulaire. Après avoir soudié les cellules, gardez les cellules dans l’obscurité pour éviter de photobleaching les fluorophores.
Pour corréler l’hypermutation somatique avec la maturation d’affinité d’anticorps, nous recommandons d’utiliser un protocole de vaccination et d’analyse pour des titres spécifiques d’anticorps d’antigène et des mutations de région de V.
