이 프로토콜은 사용자가 어떻게 면역 계통이 병원체 또는 교만 미생물에 항체를 생성하는지 연구할 수 있습니다. 또한 면역글로불린 유전자 다양화를 조절하는 분자 경로는 유전자 조작 된 마우스를 사용하여 연구 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 PCR 및 Sanger 시퀀싱을 포함한 일반적인 분자 생물학 기술의 조합을 사용하며 단일 세포 정렬 또는 심층 시퀀싱이 필요하지 않습니다.
Peyer의 패치는 주변 지방 조직과 쉽게 혼동 될 수 있습니다. 따라서 이 방법의 시각적 데모는 이 기관에 익숙하지 않은 사람들에게 해당 위치를 식별하고 해부를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 복부가 노출된 해부 패드에 마우스를 놓는 것으로 시작합니다.
해부 영역을 살균하기 위해 절개를 하기 전에 마우스 의 몸을 70 % 에탄올로 넉넉하게 분사하십시오. 복부를 가로 질러 피부에 절개를하고 손가락이나 집게로 절개의 양쪽에 동시에 당깁니다. 그런 다음 내부 장기를 노출하기 위해 가위로 복막 구멍을 잘라냅니다.
소장을 찾아 위장 아래와 cecum 위에 절단하여 제거합니다. 소장의 주름을 함께 연결하는 결합 조직과 지방을 제거하십시오. 반투명 상피 세포의 얇은 층 아래에 흰색으로 나타나는 작은 타원형 구조인 Peyer의 패치에 대한 소장의 외부 표면을 검사합니다.
눈에 보이는 Peyer의 패치를 가위로 조심스럽게 소비하고 얼음에 FACS 버퍼 1밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 수집합니다. 수집 된 조직이 튜브의 바닥에 가라 앉으면 실제로 Peyer의 패치가 아닌 지방 조직입니다. 차가운 FACS 버퍼 1밀리리터가 있는 6개의 웰 접시에 40마이크로 미터 필터를 넣은 다음 1.5 밀리리터 튜브에서 Peyer의 패치를 필터에 붓습니다.
결합 조직만 남아있을 때까지 필터에 Peyer의 패치를 분쇄하는 유봉으로 1 밀리리터 주사기에서 플런거의 평평한 끝을 사용합니다. 필터와 플런저를 차가운 FACS 버퍼 1밀리리터로 세척하여 세포를 6개의 웰 디쉬로 방출합니다. 세포를 수집하고 40 마이크로 미터 스트레이너 캡 FACS 튜브를 통해 필터링합니다.
그런 다음 차가운 FACS 버퍼의 1 밀리리터로 스트레이너 캡을 씻으세요. 펠릿은 5 분 동안 섭씨 4도에서 600G에서 세포를 원심 분리하여 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 감소시키고 FC 블록으로 차가운 FACS 버퍼의 0.4 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
15 분 동안 얼음에 샘플을 배양 한 다음 세척하고 세포를 펠릿. Germinal 센터 B 세포 또는 GCBC를 염색하려면 FACS 버퍼의 80 마이크로 리터에서 야생 형 세포를 다시 중단하십시오. 각 염색 제어에 대해 야생 유형 Peyer의 패치에서 10 마이크로리터의 셀을 제거합니다.
실험 용 샘플에 대한 세포 현탁액의 40 마이크로 리터를 남깁니다. 또는 염색 컨트롤에 보정 구슬을 사용합니다. 얼음에 15 분 동안 PNA 비오틴의 2.5 마이크로 리터와 차가운 FACS 버퍼의 500 마이크로 리터에 실험 샘플을 각각 얼룩.
그런 다음 PNA 얼룩 세포를 씻으신다. 어두운 색과 얼음에 500 마이크로 리터의 GCBC 칵테일을 가진 각 샘플을 15 분 동안 얼룩, 세포가 완전히 칵테일에 다시 중단되어 있는지 확인. 보상 매트릭스에 대한 단일 얼룩 컨트롤을 준비하려면 텍스트에 지정된 희석을 사용하여 500 마이크로리터의 콜드 FACS 버퍼에 세포를 얼룩지게 합니다.
얼음에 어둠 속에서 스테인링 컨트롤을 15분 동안 배양합니다. 모든 얼룩 샘플 및 컨트롤을 세척하는 차가운 FACS 버퍼의 두 밀리리터를 추가합니다. 세포에 펠릿과 세포계에서 실행하는 차가운 FACS 버퍼의 500 마이크로 리터의 최종 볼륨에서 세포를 다시 중단하기 전에 상체를 폐기.
그런 다음, 세포 선별기를 사용하여 각 염색된 실험 샘플로부터 B220 양성 PNA 고세포를 수집한다. 발생 센터 B 세포 또는 GCBC에서 DNA를 추출하기 위해, DNA 추출 버퍼 500 마이크로리터와 Proteinase K.의 5 마이크로리터에서 세포를 다시 중단한 다음 500 마이크로리터의 이소프로판올과 글리코겐 1마이크로리터로 DNA를 침전시한다. 그리고 튜브를 5~6번 반전시켜 튜브를 완전히 섞는다.
실온에서 10분 동안 시료를 배양한 후 원심분리기는 21, 000G 및 섭씨 25도에서 15분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 DNA 펠릿을 70%의 에탄올 1밀리리터로 씻으십시오. DNA를 21, 000G에서 10분 동안 원심분리한 다음 에탄올을 제거하고 펠릿을 5~10분 동안 공기 건조시합니다.
TE 버퍼의 30 마이크로 리터에서 DNA를 다시 중단하고 섭씨 56도에서 하룻밤 을 배양. JH4 인트론에 대해 중첩된 PCR을 수행합니다. 제1 PCR에서 사용되는 게놈 DNA의 총량을 가장 적게 농축된 샘플로 정상화한다.
젤에 PCR 제품을 실행 한 후, 앰플리콘을 소비하고 젤 추출 키트로 정화. 그런 다음 앰플리톤을 플라스미드로 소송하고 결찰 반응의 두 개의 마이크로리터로 전기 유능한 세균 세포를 변형시킵니다. 1.65킬로볼트에서 세포를 전기화하고 225 RPM에서 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 SOC 매체 600 마이크로리터에서 이를 구출합니다.
변형된 박테리아의 100마이크로리터를 LB 한천 플레이트에 판에 담미실린으로 보충하고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 세균성 식민지로부터 플라즈마 DNA를 서열화하고 Clustal 오메가 소프트웨어를 사용하여 JH4 Intron 참조 서열에 대해 각 PCR에 대해 얻은 서열을 정렬합니다. 참조 서열의 차이를 돌연변이로 식별합니다.
발아 센터 B 세포는 B220 수용체의 발현과 땅콩 아글루티닌의 결합을 측정하여 확인되었다. 야생 식 Peyer의 패치에는 마우스 당 평균 4 백만 개의 세포가 포함되어 있습니다. 그리고 세포의 약 8%는 Aid 녹아웃 마우스에서 관찰되는 것의 절반인 B220 양성 PNA 높았다.
야생형 발아센터 B세포로부터 얻어진 105개의 독특한 서열 중 총 226개의 돌연변이가 발견되었다. 돌연변이 스펙트럼의 분석은 염기 쌍당 음의 제 3 돌연변이에 4배 10의 속도로 전이 및 트랜스 버전의 범위를 나타냈다. 113개의 AID 녹아웃 서열에서 단 2개의 돌연변이만이 확인되었습니다.
추가적으로, 야생 형 Germinal 센터 B 세포에서 각 JH4 PCR 제품은, 1 개의 순서에서 자주 찾아낸 다중 돌연변이를 가진 1- 25 돌연변이를 포함했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 세포 생존가능성을 유지하기 위해 세포를 얼음 위에 보관해야 합니다. 세포를 염색 한 후, 형광 표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 세포를 유지합니다.
체세포 과민성 과 항체 친화성 성숙을 연관시키기 위해 예방 접종 프로토콜을 사용하고 항원 특이적 항체 티터 및 V 영역 돌연변이에 대한 분석하는 것이 좋습니다.
