פרוטוקול זה מאפשר למשתמשים לחקור כיצד המערכת החיסונית מייצרת נוגדנים לפתוגנים או למיקרואורגניזמים קומנסליים. בנוסף, מסלולים מולקולריים המווסתים גיוון גנים אימונוגלובולין ניתן ללמוד באמצעות עכברים מהונדסים גנטית. הפרוטוקול משתמש בשילוב של טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כולל PCR ו רצף סנגר ואינו דורש מיון תא יחיד או רצף עמוק.
ניתן לבלבל בקלות את הטלאים של Peyer עם רקמת השומן שמסביב. אז הדגמה חזותית של שיטה זו עשויה להיות מועילה עבור אלה שאינם מכירים את האיבר הזה כדי לזהות את מיקומו ולבחון את הניתוח שלה. התחל על ידי הנחת העכבר על כרית הניתוח עם הבטן חשופה.
לרסס בנדיבות את הגוף של העכבר עם 70% אתנול לפני ביצוע חתכים כדי לעקר את אזור הניתוח. בצע חתך לתוך העור על פני הבטן ולמשוך בו זמנית משני צידי החתך עם אצבעות או מלקחיים. ואז לחתוך את חלל הצפק עם מספריים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
לאתר את המעי הדק ולהסיר אותו על ידי חיתוך מתחת לקיבה ומעל cecum. הסר כל רקמת חיבור ושומן המקשרים את קפלי המעי הדק יחד. בדוק את המשטח החיצוני של המעי הדק עבור תיקונים של Peyer, שהם מבנים קטנים בצורת אליפסה המופיעים לבנים מתחת לשכבה דקה של תאי אפיתל שקופים.
בזהירות בלו את כל המדבקות של פייר גלוי עם מספריים ולאסוף אותם לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ FACS על קרח. אם הרקמה שנאספה שוקעת לתחתית הצינור, זה למעשה טלאי של פייר ולא רקמת שומן. מניחים מסנן 40 מיקרו מטר בצלחת שש באר עם מיליליטר אחד של חיץ FACS קר, ולאחר מכן לשפוך את תיקוני פייר מצינור 1.5 מיליליטר על המסנן.
השתמש בקצה השטוח של הבולעת ממזרק מיליליטר אחד כמו עלה כדי למחוץ את התיקון של פייר על המסנן עד שרקמת החיבור תישאר. לשטוף את המסנן ואת הוכנה עם מיליליטר אחד של חיץ FACS קר לשחרר את התאים לתוך צלחת שש באר. לאסוף את התאים ולסנן אותם דרך צינור 40 מיקרומטר מסננת כובע FACS.
לאחר מכן לשטוף את מכסה מסננת עם מיליליטר אחד של חיץ FACS קר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 600G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז decant supernatant ו resuspend התאים ב 0.4 מיליליטר של מאגר FACS קר עם בלוק FC.
דגירה דגימות על קרח במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף גלולות התאים. כדי להכתים את תאי מרכז B או GCBCs, השתמש מחדש בתאי סוג הבר ב- 80 מיקרוליטרים של מאגר FACS. הסר 10 מיקרוליטרים של תאים מסוג פראי תיקונים של פייר עבור כל פקד כתמים.
משאיר 40 מיקרוליטרים של השעיית התא לדגימות הניסוי. לחלופין, השתמש בקרוזי פיצוי עבור פקדי הכתמים. הכתימו כל אחת מהדגימות הניסיוניות ב-500 מיקרוליטרים של חיץ FACS קר עם 2.5 מיקרוליטרים של PNA Biotin במשך 15 דקות על קרח.
ואז לשטוף את תאי כתם PNA. הכתימו כל דגימה עם 500 מיקרוליטרים של קוקטייל GCBC בחושך ועל קרח במשך 15 דקות, מוודאים שהתאים מתווסבים במלואם בקוקטייל. כדי להכין את פקדי הכתם הבודדים עבור מטריצת הפיצוי, הכתים את התאים ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר FACS קר באמצעות הדילול שצוין בטקסט.
דגירה פקדי הכתמים בחושך על הקרח במשך 15 דקות. הוסף שני מיליליטר של מאגר FACS קר לשטוף את כל דגימות הכתמים ופקדים. גלול את התאים ולהשליך את supernatant לפני resuspending התאים בנפח הסופי של 500 microliters של מאגר FACS קר לרוץ על cytometer.
לאחר מכן, השתמש במסדר תאים כדי לאסוף את התאים הגבוהים PNA החיובי B220 מכל מדגם ניסיוני מוכתם. כדי לחלץ את הדנ"א מתאי B של מרכז החיידקים או GCBCs, השוהים מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר מיצוי דנ"א וחמישה מיקרוליטרים של Proteinase K.Then מזרזים את הדנ"א עם 500 מיקרוליטרים של איזופרופנול ומיקרוליטר אחד של גליקוגן. ולערבב את הצינור ביסודיות על ידי היפוך זה חמש או שש פעמים.
לאחר הדגירה של הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה זה במשך 15 דקות ב 21, 000G ו 25 מעלות צלזיוס. להשליך את גלולת DNA supernatant ולשטוף עם מיליליטר אחד של 70% אתנול. צנטריפוגה ה-DNA ב 21, 000G במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את האתנול אוויר לייבש את גלולה במשך חמש עד 10 דקות.
תחדש את הדנ"א ב-30 מיקרוליטרים של חיץ TE ותדגיר אותו בן לילה ב-56 מעלות צלזיוס. בצע PCR מקונן עבור Intron JH4. נרמול הכמות הכוללת של דנ"א גנומי המשמש PCR הראשון לדגימה מרוכזת לפחות.
לאחר הפעלת מוצרי PCR על ג'ל, בלו את האמפליקון ולטהר אותו עם ערכת מיצוי ג'ל. ואז להתדיין האמפליקון לתוך פלסמיד ולהפוך תאים חיידקיים אלקטרו מוסמך עם שני microliters של תגובת קשירה. Electroporate התאים ב 1.65 קילו וולט ולהציל אותם ב 600 מיקרוליטרים של מדיה SOC במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב 225 סל"ד.
צלחת 100 מיקרוליטרים של החיידקים שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB בתוספת אמיטצילין ולהדגיר את הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. רצף DNA פלזמה ממושבות חיידקים וליישר את הרצפים שהושגו עבור כל PCR נגד רצף הפניה JH4 Intron באמצעות תוכנת אומגה קלוסטלית. זהה הבדלים מרצף ההפניות כמוטציות.
תאי מרכז B Germinal זוהו על ידי מדידת ביטוי של קולטן B220 וקבילה של אגלוטינין בוטנים. טלאים מסוג פראי של פייר הכילו בממוצע 4 מיליון תאים לעכבר. וכ -8% מהתאים היו B220 חיובי PNA גבוה שהוא מחצית מזה שנצפה בעכברי נוקאאוט AID.
מתוך 105 הרצפים הייחודיים המתקבלים מתאי מרכז B של סוג הבר, נמצאו בסך הכל 226 מוטציות. ניתוח ספקטרום המוטציה הראה מגוון של מעברים וגרסאות טרנס בקצב של פי 4 פי 10 למוטציות השלישיות השליליות לכל זוג בסיס. רק שתי מוטציות זוהו ב-113 רצפי נוקאאוט של איידס.
בנוסף, כל מוצר JH4 PCR מסוג פראי תאי מרכז גרינלי B, הכיל אחד עד 25 מוטציות עם מוטציות מרובות נמצא לעתים קרובות על רצף אחד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לשמור את התאים על הקרח כדי לשמר את הכדאיות של התא. לאחר הכתמת התאים, לשמור על התאים בחושך כדי למנוע photobleaching פלואורופורים.
כדי לתאם היפרמוטציה סומטית עם התבגרות זיקה לנוגדנים, אנו ממליצים להשתמש בפרוטוקול חיסון ולשאוף עבור טיטרים נוגדנים ספציפיים אנטיגן מוטציות באזור V.
