Questo protocollo consente agli utenti di studiare come il sistema immunitario produce anticorpi contro agenti patogeni o microbi commensali. Inoltre, le vie molecolari che regolano la diversificazione genica dell'immunoglobulina possono essere studiate utilizzando topi geneticamente modificati. Il protocollo utilizza una combinazione di tecniche comuni di biologia molecolare tra cui il sequenziamento pcr e sanger e non richiede lo smistamento di singole cellule o il sequenziamento profondo.
Le patch del peyer possono essere facilmente confuse con il tessuto adiposo circostante. Quindi la dimostrazione visiva di questo metodo può essere utile per coloro che non hanno familiarità con questo organo per identificarne la posizione e osservarne la dissezione. Inizia posando il mouse sul pad di dissezione con l'addome esposto.
Spruzzare generosamente il corpo del topo con il 70% di etanolo prima di effettuare eventuali incisioni per sterilizzare l'area di dissezione. Fare un'incisione nella pelle attraverso l'addome e tirare contemporaneamente su entrambi i lati dell'incisione con dita o forcep. Quindi tagliare la cavità peritoneale con le forbici per esporre gli organi interni.
Individuare l'intestino tenue e rimuoverlo tagliando sotto lo stomaco e sopra il cieco. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e grasso che colleghi le pieghe dell'intestino tenue insieme. Esaminare la superficie esterna dell'intestino tenue per le chiazze di Peyer, che sono piccole strutture di forma ovale che appaiono bianche sotto un sottile strato di cellule epiteliali traslucide.
Asporta con cura tutte le patch di Peyer visibili con le forbici e raccoglile in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di tampone FACS sul ghiaccio. Se il tessuto raccolto affonda sul fondo del tubo, è in realtà un cerotto di Peyer e non tessuto adiposo. Posizionare un filtro di 40 micro metri in un piatto da sei pozzetto con un millilitro di tampone FACS freddo, quindi versare le patch di Peyer dal tubo da 1,5 millilitri sul filtro.
Utilizzare l'estremità piatta dello stantuffo da una siringa millilitro come pestello per schiacciare le chiazze di Peyer sul filtro fino a quando non rimane solo il tessuto connettivo. Lavare il filtro e lo stantuffo con un millilitro di tampone FACS freddo per rilasciare le cellule nel piatto a sei pozzi. Raccogliere le celle e filtrarle attraverso un tappo filtrante da 40 micrometri tubo FACS.
Quindi lavare il tappo del colino con un millilitro di tampone FACS freddo. Pellettare le cellule centrifugandole a 600G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi decantare il supernatante e rimescolare le cellule in 0,4 millilitri di tampone FACS freddo con blocco FC.
Incubare i campioni sul ghiaccio per 15 minuti, quindi lavare e pelletare le cellule. Per macchiare le cellule B del centro germinale o i CFC, rimorsi le cellule di tipo selvatico in 80 microlitri di tampone FACS. Rimuovere 10 microlitri di cellule dalle patch di Peyer di tipo selvatico per ogni controllo di colorazione.
Lasciando 40 microlitri della sospensione cellulare per i campioni sperimentali. In alternativa, utilizzare perline di compensazione per i controlli di colorazione. Macchiare ciascuno dei campioni sperimentali in 500 microlitri di tampone FACS freddo con 2,5 microlitri di Biotina PNA per 15 minuti sul ghiaccio.
Quindi lavare le cellule di macchia PNA. Macchiare ogni campione con 500 microlitri di cocktail GCBC al buio e sul ghiaccio per 15 minuti, assicurandosi che le cellule siano completamente rimorsi nel cocktail. Per preparare i singoli controlli delle macchie per la matrice di compensazione, macchiare le celle in 500 microlitri di tampone FACS freddo utilizzando la diluizione specificata nel testo.
Incubare i controlli di colorazione al buio sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere due millilitri di tampone FACS freddo per lavare tutti i campioni e i controlli delle macchie. Pellet le cellule e scartare il supernatante prima di rimescolare le cellule in un volume finale di 500 microlitri di tampone FACS freddo per funzionare sul citometro.
Quindi, utilizzare uno smistatore di celle per raccogliere le cellule alte PNA positive B220 da ogni campione sperimentale macchiato. Per estrarre il DNA dalle cellule B del centro germinale o GCCC, rimescolare le cellule in 500 microlitri del tampone di estrazione del DNA e cinque microlitri di Proteinasi K.Quindi precipitare il DNA con 500 microlitri di isopropanolo e un microlitro di glicogeno. E mescolare accuratamente il tubo inverterlo cinque o sei volte.
Dopo aver incubato il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugarlo per 15 minuti a 21.000G e 25 gradi Celsius. Scartare il supernatante e lavare il pellet di DNA con un millilitro di 70%etanolo. Centrifugare il DNA a 21.000G per 10 minuti, quindi rimuovere l'etanolo e asciugare ad aria il pellet per cinque-10 minuti.
Rimospendare il DNA in 30 microlitri di tampone TE e incubarlo durante la notte a 56 gradi Celsius. Eseguire PCR annidato per JH4 Intron. Normalizzazione della quantità totale di DNA genomico utilizzato nella prima PCR al campione meno concentrato.
Dopo aver eseguono i prodotti PCR su un gel, asportare l'amplicon e purificarlo con un kit di estrazione del gel. Quindi litigare l'amplicon in un plasmide e trasformare le cellule batteriche elettro competenti con due microlitri della reazione di legatura. Elettroporare le cellule a 1,65 kilovolt e salvarle in 600 microlitri di supporti SOC per un'ora a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di scuotimento a 225 giri/min.
Piastra 100 microlitri dei batteri trasformati su piastre di agar LB integrate con ampicillina e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Sequenziare il DNA plasmatico dalle colonie batteriche e allineare le sequenze ottenute per ogni PCR alla sequenza di riferimento JH4 Intron utilizzando un software Omega Clustal. Identificare le differenze dalla sequenza di riferimento come mutazioni.
Le cellule B centro germinali sono state identificate misurando l'espressione del recettore B220 e il legame dell'agglutinina di arachidi. Le patch di Peyer di tipo selvaggio contenevano in media 4 milioni di cellule per topo. E circa l'8% delle cellule erano ad alto PNA positivo B220, che è la metà di quello osservato nei topi knockout AID.
Delle 105 sequenze uniche ottenute da cellule B centro germinali di tipo selvatico, sono state trovate complessivamente 226 mutazioni. L'analisi dello spettro di mutazioni ha mostrato una gamma di transizioni e versioni trans ad una velocità di quattro per 10 alla terza mutazione negativa per coppia di basi. Solo due mutazioni sono state identificate in 113 sequenze knockout AID.
Inoltre, ogni prodotto PCR JH4 proveniente da cellule B centro germinali di tipo selvatico conteneva da una a 25 mutazioni con mutazioni multiple frequentemente trovate su una sequenza. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di mantenere le cellule sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare. Dopo aver macchiato le cellule, tenere le cellule al buio per evitare il fotobleaching dei fluorofori.
Per correlare l'ipermutazione somatica con la maturazione dell'affinità anticorpale, si consiglia di utilizzare un protocollo di immunizzazione e saggiare per titolo anticorpale specifico di antigene e mutazioni della regione V.
