يسمح نظامنا للباحثين باستثارة الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة غير المتدرجة وتحديد تيار الكالسيوم أثناء استجابات المهيجات للاهتزازات. كميزة رئيسية لهذه التقنية ، يمكننا التحقيق بشكل غير جراحي في الآليات العصبية ، والآليات الأساسية للسلوك. قم بإعداد وسط نمو نيماتودا جديد أو صفيحة NGM التي يتم فيها رسم الإشريكية القولونية OP50 في نمط مربع باستخدام موزع الخلايا بحيث تقضي الدودة معظم الوقت في البكتيريا أثناء تصوير الكالسيوم.
قبل أربعة أيام من تجربة تصوير الكالسيوم، انقل اثنين من ديدان ST12 البالغة إلى اللوحة، وضع الصفيحة في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. قم بإجراء تصوير الكالسيوم باستخدام مجهر مجهز بجهاز محول صوتي للتحفيز ، وعدسة موضوعية 2x ، وكاميرا CMOS عالية السرعة ، وبصريات تقسيم الصور. قم بتشغيل الكمبيوتر الدقيق في وحدة التحكم في المرحلة X Y المزودة بمحرك.
ثم قم بتشغيل مكبر الصوت واضبط ضبط مستوى الصوت على 10 في القاعدة وضبط ثلاثة أضعاف على ثمانية. لإثارة GCaMP ووضع علامة على RFP ، قم بتشغيل مصابيح 488 و 560 نانومتر لمصدر ضوء LED. اضبط مقاييس 470 و 550 نانومتر لجراب التحكم في مصدر الضوء على 5٪ بحيث تكون شدة ضوء LED مناسبة للتصوير.
قم بتنزيل حزم البرامج والنوافذ التالية وتثبيتها. برنامج ماكرو الماوس ، وبرنامج للتحكم في الاهتزاز ، وبرنامج لتشغيل التتبع ، وبرنامج لتحليل البيانات. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف برنامج التتبع ، ثم اضبط وقت التعرض على 0.033 ثانية ، وقم بالتثبيت على اثنين في اثنين لضمان الحصول على الصور بسلاسة.
انقر فوق زر التشغيل وانتظر لمدة خمس دقائق لتحقيق الاستقرار في البرنامج. أدخل المعلومات للحصول على الصورة. على سبيل المثال، لتسجيل 500 صورة بدون فاصل زمني، أدخل 500 في المربع إجمالي الصور، و500 في مربع الصور، وصفر في مربع الفواصل الزمنية.
بعد تشغيل زر الاقتناء، قم بتقسيم صورة التألق باستخدام بصريات تقسيم الصورة، وإسقاط قناة GCaMP ووضع علامة على قناة RFP على نصفين من كاميرا CMOS. معايرة إحداثيات GCaMP ووضع علامة على قنوات RFP وحفظ الإعدادات. ثم قم بتعيين الدليل لإخراج ملف البيانات وإيقاف تشغيل عملية الاستحواذ.
اقرأ الفحص. ملف نصي مع نظام الماكرو الماوس بحيث يتم التحكم في مؤشر الماوس بناء على الإحداثيات والجدول الزمني في هذا الملف وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف البرنامج للتحكم في الاهتزاز. اضبط إحداثيات مؤشر الماوس في وقت الانتظار حتى التحفيز بعد بدء التسجيل، ثم اضبط قيم التردد والسعة في البرنامج للتحكم في الاهتزاز.
انقل دودة واحدة تعبر عن كل من GCaMP و RFP من اللوحة المحتضنة إلى لوحة NGM جديدة حيث تم خط E coli OP50. قم بتوصيل لوحة NGM بمحول الطاقة الصوتي باستخدام شريط لاصق شفاف. لتصوير الكالسيوم ، قم بتشغيل زر الاكتساب وابحث عن الدودة عند تكبير 2.5x.
اضبط مجال الرؤية على أنه 1.1 × 1.1 ملم بدقة 2.6 ميكرون لكل بكسل. أطفئ الضوء الساطع وانقر على زر التوجيه لتتبع بقعة الفلورسنت للدودة ، والتي تبدأ حركة مرحلة X Y للحفاظ على منطقة الكثافة القصوى للدودة في منتصف مجال الرؤية في صورة طلب تقديم العروض للعلامة. تأكد من أن قيم الكثافة حوالي 1000.
إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بضبط مقاييس 470 و 550 نانومتر لجراب التحكم في مصدر الضوء. اضغط على زر التشغيل في نظام الماكرو بالماوس للسماح بالتحكم في مؤشر الماوس، وتحقق من إنشاء ملف BMP الناتج بشكل مناسب. لتحليل البيانات ، قم بإنشاء مجلد على سطح المكتب وتسميته تصوير الكالسيوم"ثم قم بإنشاء مجلد داخل مجلد تصوير الكالسيوم وقم بتسميته نتيجة CI لملفات نتائج الإخراج.
انقر نقرا مزدوجا فوق تصوير العرض المزدوج. ملف MB مكتوب في برنامج تحليل البيانات، وأدخل مسارات الملفات في مجلد نتائج CI في المجلد الذي يحتوي على ملف BMP. ادفع مفتاحي shift وReturn في وقت واحد لبدء تحليل تلقائي، والذي يستخدم قيمة منطقة الكثافة القصوى في صورة طلب تقديم العروض للعلامة.
أخيرا ، تحقق مما إذا كانت ملفات الإخراج قد تم إنشاؤها بشكل مناسب في مجلد نتائج CI. في التحليل التمثيلي ، تم الحصول على بيانات قناة GCaMP و RFP كسلسلة من الصور. كما تم تحديد كمية إزاحة طبق بتري الناجم عن نظام الاهتزاز غير الموضعي.
يمكن التحكم في الإزاحة عن طريق تعيين قيمة السعة في البرنامج للتحكم في الاهتزاز ، وضابط مستوى الصوت ومكبر الصوت. في حين يمكن تنظيم التردد عن طريق تعيين قيمة التردد في البرنامج. لوحظت استجابة كالسيوم عابرة للخلايا العصبية AVA عند التحفيز مع اهتزازات لها تردد 630 هرتز وإزاحة تبلغ حوالي 4.5 ميكرومتر في الثانية ، مما يشير إلى أن خلية Ava العصبية تم تنشيطها أثناء استجابة الدودة الخلفية للتحفيز غير الموضعي.
في إجراءنا ، يمكننا تحديد كمية خلية عصبية واحدة فقط. ومع ذلك ، يمكن أيضا دمج هذا النظام مع طريقة التصوير البيومترية لتحديد كمية الخلايا العصبية المتعددة أو حتى الدماغ بأكمله بشكل غير جراحي.
