يستخدم هذا البروتوكول طريقة قابلة لإعادة التدوير ومعدلة في إنتاج المركبات الحلقية اللولبية. يساعد اختبار MTT في الإجابة على السؤال المتعلق بالسمية الخلوية لهذه الجزيئات الجديدة. تنتج هذه التقنية جزيئات جديدة قابلة للتعديل باستخدام مادة بدء متجددة.
يوفر اختبار MTT نتائج بيولوجية سريعة نسبيا وسهلة التحليل ابدأ بإجراء تخليق الطور الصلب لدورات غير متجانسة الحلقية السادسة والسابعة ، كما هو موضح سابقا. تحضير 20 ملليلتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر محلول MTT باستخدام PBS معقم كمادة مخففة. تصفية وتخزين الحل في ناقص 20 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف فردي لمحلول MTT في DMEM. قم بإعداد ملليلتر واحد لكل من محاليل المخزون في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر من مركبات الاختبار في DMSO. تخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
تحضير 200 ميكرولتر لكل جرعة من حلول العمل لمركبات الاختبار عن طريق تخفيف تركيزات المخزون. واحد إلى 1000 في وسط خال من المصل. في بذور زراعة الأنسجة ، عالجت خلايا COS السبع في وسط كامل على زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح 96 لوحة بئر بتركيز 4،000 خلية لكل 200 ميكرولتر لكل بئر.
باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بشفط المادة الطافية من الآبار باستخدام ماصة مرعى زجاجية متصلة بمضخة تفريغ.
جرعة الخلايا في ثلاث نسخ مع مركبات الاختبار باستخدام حلول العمل المعدة مسبقا. ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة ، قم بشفط المادة الطافية من الآبار وأضف 200 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر.
احتضان اللوحة لمدة أربع ساعات. استنشاق الطافية برفق من الآبار دون إزعاج بلورات الفورمازان الأرجواني. أضف 200 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة البلورات.
ثم احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بقياس الامتصاص لكل بئر عند 590 أو 600 نانومتر باستخدام قارئ لوحة 96 بئر. استخدم الآبار التي لا تحتوي على خلايا كخلفية وقم بحساب متوسط قيمة الامتصاص.
تم تصنيع طبقات gox الحلقية ستة وسبعة باستخدام بروتوكول معدل. تمت مراقبة تقدم التفاعل من خلال الكشف عن اختفاء ألفا بيتا غير المشبعة إستر باستخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. تم استخدام اختبار MTT لتحديد صلاحية الخلية.
سيسبلاتين ، المعروف بتحفيز موت الخلايا بتركيزات عالية ، كان بمثابة عنصر تحكم إيجابي. كما هو متوقع ، كلما زاد تركيز سيسبلاتين كلما انخفضت صلاحية الخلية. ثم تم استخدام مقايسة MTT لاختبار المركبات الحلقية ستة وسبعة وفورفوريلامين.
أظهر فورفوريلامين والتماس gox الحلقية ستة سمية خلوية مماثلة. ومع ذلك ، كانت سمية المركب الحلقية سبعة أكبر بشكل ملحوظ من سمية فورفوريلامين وستة. عند محاولة هذا البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن N-alkylation الذي تم إجراؤه باستخدام هاليدات الأسيل الضخمة قد وجد أنه يقلل من معدل التخلص من بيتا وبالتالي تقليل إنتاجية المنتج.
