المستدمية النزلية هي سبب رئيسي للالتهابات في مختلف أمراض الرئة المزمنة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن والالتهاب الرئوي. يصف هذا البروتوكول طرق تقييم تأثير المستدمية على التهاب الرئة. مزايا هذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء تقييم شامل للاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية.
احتضان 450 ميكرولترا من الدم المحيطي مع 50 ميكرولترا من يوديد البروبيديوم المنشط المسمى H influenzae في أنبوب سعة خمسة ملليلتر لمدة 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. أخرج العينة من الحمام المائي ، وأضف خمسة ميكرولتر من DHR ودوامة لمدة 10 ثوان. ثم ضعه مرة أخرى في حمام مائي لمدة 10 دقائق أخرى.
بعد إزالة العينة من حمام مائي ، قم بتحليل كريات الدم الحمراء بخمسة ملليلتر من محلول كلوريد الأمونيوم 0.8٪ وتحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في النص. قسم عينة الدم المحيطية إلى حصص للتحكم وتحفيز المستضد. أضف الأجسام المضادة المكلفة إلى كلتا العينتين.
ثم أضف النزلة النزلية H غير القابلة للكتابة إلى عينة المستضد واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف عامل حجب Golgi brefeldin A إلى العينات واحتضانها لمدة خمس ساعات أخرى. بعد تحليل كريات الدم الحمراء كما هو موضح سابقا ، قم بإصلاح الكريات البيض باستخدام 500 ميكرولتر من واحد إلى 2٪ بارا فورمالدهايد لمدة ساعة واحدة.
عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، ثم تخلل مليون خلية مع 100 ميكرولتر من الصابونين 0.1٪ لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بأجسام مضادة مناسبة تحمل علامة الفلورسنت. اغسل الخلايا ، ثم قم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
أوجد نسبة الخلايا المستجيبة لمولد الضد عن طريق الحصول على تجمعات الخلايا الليمفاوية ذات الصلة. قم بإجراء تلطيخ الخلفية على الخلايا غير المحفزة لجميع السيتوكينات المراد تحليلها. قم بتقطيع حوالي 20 إلى 40 جراما من عينة استئصال الفص إلى ثلاثة إلى خمسة أقسام ملليمترية مكعبة.
ضعها داخل غرفة معقمة سعة 50 ميكرولتر وقم بتفتيت الأنسجة ميكانيكيا باستخدام أداة تجميع مناسبة. بعد تكسير الأنسجة ، قم بتحليل خلايا الدم الحمراء كما هو موضح وأعد تعليق الخلايا في RPMI المعقم. ثم قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون معقمة 100 ميكرومتر وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق.
بالنسبة لفحص العدوى ، أعد تعليق خلايا الرئة في RPMI إلى تركيز نهائي يبلغ 4 ملايين خلية لكل ملليلتر لكل أنبوب. ثم تصيب الخلايا في MOI من 100 بكتيريا لكل خلية. قم بفك الغطاء نصف دوران للسماح بنقل الغاز في الأنابيب.
ضع الخلايا في دوار الأنبوب واحتضنها عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 12 دورة في الدقيقة. بعد ساعة واحدة من التحفيز ، أضف grefeldin A لمنع تصدير السيتوكينات خارج الخلية واحتضان معلقات الخلايا لمدة 16 إلى 22 ساعة أخرى مع الدوران. في اليوم التالي ، اغسل معلق الخلية ب 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري و 0.01٪ أزيد الصوديوم.
بعد ذلك ، قم بتلطيخ معلق الخلية لعلامات سطح خلية الخلايا الليمفاوية البشرية المحددة لمدة ساعة واحدة. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS وقم بإصلاحها واختراقها كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لمدة ساعة واحدة.
ثم اغسل الخلايا وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS قبل الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي. قياس التحلل البروتيني عن طريق عمل البروتينات المعدنية ، إضافة الفلوريسئين المسمى الركيزة الجيلاتين مباشرة على شرائح قسم أنسجة الرئة. ضع الشرائح أفقيا واحتضنها في غرفة مرطبة محمية بالضوء عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
لتحضير عناصر تحكم سلبية ، أضف مخزن مؤقت تفاعل × بدون جيلاتين فلوري إلى الأقسام لمزيد من التحليل. كانت خلايا الدم الطرفية أحادية النواة مسورة باستخدام مبعثرة للأمام والجانب لتحديد عدد الخلايا البلعمية. تم تعريف مجتمع الخلايا البلعمية أيضا من خلال تعبير CD14 لتسمية الخلايا الوحيدة.
تم إجراء قياس ROS عن طريق أكسدة DHR 123 لإنتاج مضان. تمت مقارنة متوسط التألق للعينة المحفزة مع السيطرة. تم قياس إنتاج السيتوكين داخل الخلايا بواسطة الخلايا الليمفاوية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
تم تحليل الخلايا أولا لتعبيرها عن علامة الكريات البيض CD45 ثم للقرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط الرابع ، القرص المضغوط الثامن. تم تقييم الخلايا الإيجابية CD الثلاثة و CD الأربعة لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا في العينات الضابطة والمحفزة. تم قياس نشاط الأنزيم البروتيني بواسطة التصوير الزيموجرافي NC في أقسام أنسجة الرئة غير الثابتة.
أشار تلطيخ الفلورسنت إلى وجود نشاط MMP ، والذي كان أيضا موضعيا مع التعبير عن الكروماتين. تتطلب إضافة الأجسام المضادة إلى عينات أنسجة الرئة التركيز وسيتطلب تلطيخ الخلايا تحسينا في التجارب الأولية. يمكن تحليل طافت عينات أنسجة الرئة بشكل أكبر للوسطاء الالتهابيين الآخرين باستخدام تقنيات مثل ELISA و يمكن استخدام هذه التقنيات لتقييم تأثير العلاجات المحتملة على التهاب الرئة.
