الهدف العام لهذا البروتوكول هو تقديم إرشادات مفصلة لاستخدام E1A2 minigene لتقييم التغييرات العالمية في الربط بين الحمض النووي الريبي. هذه أداة سريعة وغير مكلفة وبسيطة لتقييم وظيفة البروتين المستهدف في تنظيم الربط البديل دون الحاجة إلى أنظمة خاصة أو ظروف مختبرية. ابدأ بزراعة خلايا HEK 293 مع تعبير مستقر عن جين الاهتمام.
تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين EDTA، ثم لوحة 300، 000 الخلايا لكل بئر في لوحات ست آبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة، تحقق من التقاء، وخلايا مستقرة HEK 293 transfect فقط عندما التقاء 70 إلى 80٪. إزالة بعناية وسط ثقافة الخلية مع ماصة، ثم إضافة اثنين من ملليلتر من المتوسط DMEM كاملة دون المضادات الحيوية ووضع لوحة مرة أخرى في الحاضنة.
إعداد أنبوب مع العازلة transfection، ثم إضافة ميكروغرام اثنين من الحمض النووي pMTE1A، دوامة، وإضافة اثنين من ميكرولتر من كاشف العدوى. دوامة مرة أخرى واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة بعناية خليط العدوى قطرة الحكمة.
بعد ست ساعات من العدوى، أضف التتراسيكلين إلى خلايا HEK 293 المستقرة لتحريض تعبير Nek4. بعد 24 ساعة من العدوى، تحقق من مورفولوجيا الخلايا وكفاءة العدوى باستخدام المجهر الفلوري. استخدام ماصة لإزالة الخلايا ثقافة المتوسطة، ثم إضافة خلية الثقافة المتوسطة مع العلاج الكيميائي.
احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. لجمع الحمض النووي الريبي، تجاهل الخلايا ثقافة المتوسطة، وإضافة 0.5 إلى 1 ملليلتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة إلى البئر. إذا كانت الآبار التقاء جدا، استخدم ملليلتر واحد من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.
تجانس الخلايا مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. انتقل على الفور إلى استخراج الحمض النووي الريبي، أو تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية. إذابة العينات في غطاء الدخان واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
أضف 0.1 إلى 0.2 ملليلتر من الكلوروفورم وحرض بقوة، ثم احتضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12، 000 مرة G وأربع درجات مئوية، ثم جمع المرحلة المائية العليا ونقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 ملليلتر. جمع حوالي 60٪ من الحجم الإجمالي، ولكن لا تجمع الحمض النووي أو المرحلة العضوية.
إضافة 0.25 إلى 0.5 ملليلتر من ايزوبروبانول وتهيج العينة عن طريق عكس أربع مرات. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي في 12،000 مرة G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant. غسل بيليه الحمض النووي الريبي مرتين مع الإيثانول، والطرد المركزي في 7، 500 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم التخلص من الإيثانول.
إزالة الإيثانول الزائد عن طريق عكس الأنبوب على منشفة ورقية، ثم ترك الأنبوب مفتوحا داخل غطاء الدخان لتجفيف جزئيا بيليه لمدة خمس إلى 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه الحمض النووي الريبي في 15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC. قياس إجمالي الحمض النووي الريبي والتحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاص عند 230 و260 و280 نانومتر.
للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي الكلي، قم بتشغيل جل 1٪ agarose المعالج مسبقا مع 1.2٪ من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 2.5٪ لمدة 30 دقيقة. إجراء توليف cDNA باستخدام واحد إلى اثنين ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي. الجمع بين الجيش الملكي النيبالي، واحد ميكرولتر من أوليغو d-T، ميكرولتر واحد من DNTP، والمياه الخالية من النيوكليز إلى 12 ميكرولتر.
احتضان رد الفعل في الدورة الحرارية لمدة خمس دقائق في 65 درجة مئوية. إزالة عينات من دورة الحرارية، وإضافة أربعة ميكرولترات من العازلة النسخ العكسي، واثنين من microliters من DTT، وميكرليتر واحد من مثبط ريبونوكليز. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
أضف ميكرولتر واحد من النسخ العكسي المستقر حراريا، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. تعطيل الانزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. نفذ PCR كما هو موضح في المخطوطة النصية، ثم قم بتحميل 20 إلى 25 ميكرولتر من منتج PCR على هلام agarose بنسبة 3٪ يحتوي على وصمة عار حمض النيوكليك، وتشغيله بسرعة 100 فولت لمدة ساعة تقريبا.
تصوير الجل ، وتجنب أي تشبع الفرقة ، وتحديد النطاقات باستخدام برنامج معالجة الصور. العصابات في 631، 493، و 156 أزواج قاعدة تتوافق مع 13S، 12S، و 9S isoforms على التوالي. من قائمة ملف البرنامج، افتح ملف الصورة وحوله إلى مقياس رمادي.
ضبط السطوع والتباين، ثم إزالة الضوضاء المتطرفة إذا لزم الأمر. رسم مستطيل حول المسار الأول باستخدام أداة تحديد المستطيل، وحدده من خلال الأمر تحليل، وGels، وحدد المسار الأول، أو باستخدام اختصار لوحة المفاتيح. استخدام الماوس للنقر مع الاستمرار في منتصف المستطيل على الممر الأول، واسحبه إلى حارة المقبل.
انتقل إلى تحليل، والمواد الهلامية، وحدد حارة التالي. كرر هذه الخطوة لجميع الممرات المتبقية. بعد أن يتم تمييز جميع الممرات ورقمها ، انتقل إلى تحليل ، وGels ، و Plot Lanes لرسم مؤامرة ملف شخصي لكل حارة.
استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خط عبر قاعدة كل قمة ، مقابلة لكل نطاق ، مما يترك ضوضاء الخلفية. بعد أن تم إغلاق جميع القمم من كل حارة ، حدد أداة العصا وانقر داخل كل قمة. يجب أن تظهر القياسات في نافذة النتائج لكل قمة مميزة.
ولنتأمل هنا فقط قمم 13S و12S و9S التي تتوافق مع نطاقات أزواج 631 و493 و156 قاعدة. نسخ بيانات كثافة محرر جدول بيانات، وتلخيص كثافة من كافة النطاقات الثلاثة لكل عينة، ثم حساب النسبة المئوية لكل isoform نسبة إلى الإجمالي. رسم النسب المئوية لكل isoform، أو الاختلافات في النسبة المئوية بالنسبة للعينات غير المعالجة.
تم استخدام البلازميد الذي يحتوي على مينيجين من E1A لمراقبة التأثير على الربط البديل من خلال تقييم نسبة الحمض النووي الريبي من كل isoform المنتجة. التعبير القاعدي للمتغيرات ISOFORMS E1A تعتمد على خط الخلية والوقت للتعبير E1A. خط الخلية المستقر HEK 293 ، أو HEK 293 recombinase الذي يحتوي على موقع ، أظهر تعبيرا أعلى عن 13S بالمقارنة مع خلايا HeLa ، ولكنه أظهر مستويات مماثلة من 13S و 12S isoforms بعد 48 ساعة من التعبير E1A.
وأظهرت الخلايا المعرضة لcisplatin تحولا في خمسة رئيس S-S الربط اختيار لصالح التعبير 12S. وقد لوحظ هذا التأثير في HEK 293 التعبير عن ستابلي ناقلات العلم فارغة، فضلا عن isoform واحدة من Nek4. كانت التغييرات في الربط البديل بعد علاج باكليتاكسيل متحفظة للغاية ، ولكن اتجاهات التغييرات كانت معاكسة في Flag و Nek4 تعبر عن الخلايا.
عند تنفيذ هذا البروتوكول، من المهم استخدام عناصر تحكم النسخ غير المصابة وغير العكسية لتجنب سوء التفسير مع التعبير E1A الذاتية، وذلك بشكل رئيسي عند استخدام خلايا HEK 293. بعد الحصول على نتائج إيجابية، يمكن تقييم الربط البديل لجينات محددة تتعلق بالاستجابة للعلاج الكيميائي. عندما يلاحظ بعض التأثير، يمكن لهذا البروتوكول البسيط توجيه هذه الدراسات إلى مسارات أكثر اتساقا، حيث يلعب البروتين دورا في تنظيم الربط البديل في استجابة العلاج الكيميائي، على سبيل المثال.
