이 프로토콜의 전반적인 목표는 글로벌 mRNA 접합 변화를 평가하기 위한 미니진 E1A2를 사용하는 상세한 지침을 제공하는 것입니다. 이것은 특별한 정권 또는 실험실 조건의 필요 없이 대체 접합 규칙에 있는 표적 단백질의 기능을 평가하기 위한 빠르고 저렴하고 간단한 도구입니다. 관심 유전자의 안정적인 발현을 가진 HEK 293 세포를 배양하여 시작합니다.
0.25%의 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 분할한 다음 6웰 플레이트에서 우물당 300, 000 세포를 플레이트하고 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 70~80%의 컨할수 있는 경우에만 결합및 HEK 293의 안정셀을 확인한다. 조심스럽게 파이펫으로 세포 배양 배지를 제거한 다음 항생제없이 완전한 DMEM 배지의 2 밀리리터를 추가하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
회광 버퍼로 튜브를 준비한 다음, 2마이크로그램의 pMTE1A DNA, 소용돌이를 추가하고, 2개의 마이크로리터의 트랜스페트 시약을 추가한다. 소용돌이를 다시 하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 조심스럽게 배설 혼합물을 드롭 와이즈추가합니다.
전환 후 6시간 후, Nek4 발현 유도를 위해 HEK 293의 안정적인 세포에 테트라사이클린을 첨가한다. 전환 후 24시간, 형광 현미경을 사용하여 세포 형태및 트랜스퍼션 효율을 확인한다. 파이펫을 사용하여 세포 배양 배지를 제거한 다음 화학요법으로 세포 배양 배지를 추가합니다.
세포를 24시간 동안 배양합니다. RNA를 수집하려면, 세포 배양 배지를 버리고, 우물에 직접 RNA 추출 시약의 0.5 에서 1 밀리리터를 추가한다. 우물이 매우 혼잡한 경우 RNA 추출 시약 1 밀리리터를 사용하여 RNA 품질을 개선하십시오.
파이펫으로 세포를 균질화하고 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. RNA 추출로 즉시 진행하거나 샘플을 영하 80도에서 저장하십시오. 연기를 하는 후드에 샘플을 해동하고 실온에서 5분간 배양합니다.
0.1에서 0.2 밀리리터의 클로로폼을 넣고 격렬하게 교반한 다음 실온에서 3분간 배양합니다. 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 상부 수성 상면을 수집하여 새로운 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮긴다. 총 부피의 약 60%를 수집하지만 DNA 또는 유기상을 수집하지는 않습니다.
0.25 ~ 0.5 밀리리터의 이소프로판올을 추가하고 반전으로 샘플을 4번 교반합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000배 G로 원심분리기를 사용해 폐기합니다. RNA 펠릿을 에탄올로 두 번 세척하고 원심분리기를 7, 500회 G에서 5분간 세척한 다음 에탄올을 폐기합니다.
종이 타월에 튜브를 반전시켜 과도한 에탄올을 제거한 다음, 튜브를 연기 후드 내부에 열어 놓고 5~10분 동안 펠릿을 부분적으로 건조시하십시오. DEPC 처리 된 물의 15 마이크로 리터에서 RNA 펠릿을 다시 중단합니다. 총 RNA를 정량화하고 230, 260 및 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 RNA 품질을 검증합니다.
총 RNA 품질을 확인하려면 30분 동안 2.5%의 하이포염소산나트륨 용액의 1.2%로 전처리된 1%아가로즈 젤을 실행합니다. 총 RNA의 1 ~ 2 마이크로 그램을 사용하여 cDNA 합성을 수행합니다. RNA, 올리고 d-T의 마이크로리터 1개, DNTP의 마이크로리터 1개, 뉴클레아제 없는 물을 12마이크로리터로 결합합니다.
온도 65도에서 5 분 동안 열 순환기의 반응을 배양하십시오. Thermo Cycler에서 샘플을 제거하고 역 전사 버퍼 4개, DTT 의 마이크로리터 2개, 리보나클러 억제제 1편을 추가합니다. 섭씨 37도에서 2분간 배양하세요.
열 안정역 전사 1개를 추가하고 섭씨 37도에서 50분간 배양합니다. 15 분 동안 섭씨 70도에서 효소를 비활성화합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 PCR을 수행한 다음, 핵산 얼룩을 함유한 3%의 아가로즈 젤에 PCR 제품의 20~25마이크로리터를 적재하고 약 100볼트에서 약 1시간 동안 실행한다.
젤을 촬영하고, 밴드 채도를 피하고, 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 밴드를 정량화합니다. 631, 493 및 156 베이스 쌍의 밴드는 각각 13S, 12S 및 9S 등도형에 해당합니다. 소프트웨어의 파일 메뉴에서 이미지 파일을 열고 회색 축척으로 변환합니다.
밝기와 대비를 조정한 다음 필요한 경우 이상치 노이즈를 제거합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 첫 번째 차선 주위에 사각형을 그리고 분석, 젤 및 선택 첫 번째 차선 명령을 통해 또는 키보드 바로 가기를 사용하여 선택합니다. 마우스를 사용하여 첫 번째 차선의 사각형 중간에 클릭하고 길게 잡고 다음 차선으로 드래그합니다.
분석, 젤 및 다음 차선 선택으로 이동합니다. 남은 모든 차선에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 차선이 강조 표시되고 번호가 매겨진 후 분석, 젤 및 플롯 레인으로 이동하여 각 차선의 프로파일 플롯을 그립니다.
직선 선택 도구를 사용하여 각 대역에 해당하는 각 피크의 베이스를 가로질러 선을 그려 배경 노이즈를 남깁니다. 모든 차선의 모든 피크가 닫힌 후 지팡이 도구를 선택하고 각 피크 내부를 클릭합니다. 강조 표시된 각 피크에 대한 결과 창에 측정이 나타납니다.
631, 493 및 156개의 기본 쌍 대역에 해당하는 13S, 12S 및 9S 피크만 고려하십시오. 스프레드시트 편집기의 강도 데이터를 복사하고 각 샘플의 세 대역의 강도를 합산한 다음 합계에 비해 각 등색에 대한 백분율을 계산합니다. 각 등각형의 백분율 또는 처리되지 않은 샘플에 비해 백분율의 차이를 플롯합니다.
E1A로부터 미니진을 함유하는 플라스미드는 생성된 각 등동포로부터mRNA의 비율을 평가함으로써 대체 접합에 미치는 영향을 관찰하는 데 사용되었다. E1A 이체의 기저발식은 E1A 발현의 세포주 및 시간에 의존한다. HEK 293 의 안정세포주 또는 HEK 293 재조합 부위는 HeLa 세포에 비해 13S의 높은 발현을 보였지만, 48시간 후 E1A 발현 후 13S 및 12S 이소폼의 유사한 수준을 보였다.
시스플라틴에 노출된 세포는 12S 표현을 선호하는 5개의 프라임 S-S 접합 선택에서 변화를 보였다. 이러한 효과는 HEK 293에서 안정적으로 플래그 빈 벡터를 발현하고, Nek4 중 하나와 동위원소형태를 관찰하였다. 파클리탁셀 치료 후 대체 접합의 변화는 매우 신중했지만, 변화의 방향은 플래그와 Nek4 발현 세포에서 반대였다.
이 프로토콜을 수행할 때, HEK 293 세포를 사용하는 경우, 주로 HEK 293 세포를 사용하는 경우, 내인성 E1A 발현으로 오해를 피하기 위해 비감염 및 비 역전사 제어를 사용하는 것이 중요합니다. 양성 결과를 얻은 후 화학요법 반응과 관련된 특정 유전자의 대체 접합을 평가할 수 있다. 어떤 효력이 관찰될 때, 이 간단한 프로토콜은 단백질이 화학요법 반응에 있는 대체 접합을 통제하는 역할을 하는 일관된 통로를 위한 이 연구 결과를 지시할 수 있습니다, 예를 들면.
