המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת לשימוש ב- Minigene E1A2 להערכת שינויים גלובליים של חיבור mRNA. זהו כלי מהיר, זול ופשוט להערכת תפקודו של חלבון היעד בוויסות שכפול חלופי ללא צורך במשטרים מיוחדים או בתנאי מעבדה. התחל על ידי פולחן HEK 293 תאים עם ביטוי יציב של גן העניין.
לפצל את התאים באמצעות 0.25%טריפסין EDTA, ולאחר מכן צלחת 300, 000 תאים לבאר בשש צלחות היטב ולדגירה אותם במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, לבדוק את המפגש, ולהדביק HEK 293 תאים יציבים רק כאשר 70 עד 80% confluent. בזהירות להסיר את המדיום תרבית התא עם pipette, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של מדיום DMEM מלא ללא אנטיביוטיקה ולהחזיר את הצלחת באינקובטור.
הכן צינור עם חיץ טרנספקטיון, ולאחר מכן הוסף שני מיקרוגרם של DNA pMTE1A, מערבולת, ולהוסיף שני microliters של ריאגנט transfection. מערבולת שוב ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הצלחות מהאינקובטור ומוסיפים בזהירות את תערובת הטרנספקטיון.
שש שעות לאחר ההדבקה, הוסף טטרציקלין לתאים יציבים HEK 293 עבור אינדוקציה ביטוי Nek4. 24 שעות לאחר ההדבקה, לאמת מורפולוגיה של תאים ויעילות transfection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש pipette כדי להסיר את המדיום תרבית התא, ולאחר מכן להוסיף מדיום תרבית התא עם chemotherapeutics.
לדגור על התאים לעוד 24 שעות. כדי לאסוף RNA, להשליך את המדיום תרבית התא, ולהוסיף 0.5 עד 1 מיליליטר של ריאגנט חילוץ RNA ישירות לבאר. אם בארות הן מאוד משכנעות, להשתמש מיליליטר אחד של ריאגנט מיצוי RNA כדי לשפר את איכות הרנ"א.
הומוגניזציה התאים עם פיפטה ולהעביר אותם לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. המשך מיד לחילוץ הרנ"א, או אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את הדגימות במכסה אדים ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
מוסיפים 0.1 עד 0.2 מיליליטר של כלורופורם ונסיתים במרץ, ואז מדגירים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12, 000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאסוף את השלב מימי העליון ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. לאסוף סביב 60% מהנפח הכולל, אבל לא לאסוף את ה- DNA או את השלב האורגני.
הוסף 0.25 עד 0.5 מיליליטר של איזופרופנול ולעצבן את המדגם על ידי היפוך ארבע פעמים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לשטוף את כדורי RNA פעמיים עם אתנול, וצנטריפוגה ב 7, 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את האתנול.
הסר אתנול עודף על ידי היפוך הצינור על מגבת נייר, ולאחר מכן להשאיר את הצינור פתוח בתוך מכסה המנוע אדים לייבש חלקית את הכדור במשך חמש עד 10 דקות. להשעות מחדש את כדורי הרנ"א ב-15 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC. לכמת את הרנ"א הכולל ולאמת את איכות הרנ"א על-ידי מדידת ספיגה ב- 230, 260 ו- 280 ננומטר.
כדי לאמת את איכות הרנ"א הכוללת, הפעל ג'ל אגרוז 1%עם טיפול מראש עם 1.2% של פתרון היפוכלוריט נתרן 2.5% במשך 30 דקות. בצע סינתזת cDNA באמצעות מיקרוגרם אחד עד שניים של RNA הכולל. שלבו RNA, מיקרוליטר אחד של אוליגו D-T, מיקרוליטר אחד של DNTP, ומים ללא נוקלאז ל-12 מיקרוליטרים.
לדגור על התגובה ב מחזור התרמו במשך חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס. הסר דגימות מן מחזור התרמו, ולהוסיף ארבעה microliters של מאגר תמלול הפוך, שני microliters של DTT, ו microliter אחד של מעכב ריבונוקלאז. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס לשתי דקות.
הוסף מיקרוליטר אחד של תמלול הפוך תרמו-יציב, ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בצע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט, ולאחר מכן לטעון 20 עד 25 microliters של המוצר PCR על ג'ל 3% agarose המכיל כתם חומצה גרעין, ולהפעיל ב 100 וולט במשך כשעה אחת.
צלם את הג'ל, הימנע מרוויה של רצועה, וכמת את הרצועות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. הלהקות ב- 631, 493 ו- 156 זוגות בסיס תואמות לאיזפורמות 13S, 12S ו- 9S בהתאמה. מתפריט קובץ של התוכנה, פתח את קובץ התמונה והמרת אותו לקנה מידה אפור.
כוונן את הבהירות והחדות ולאחר מכן הסר רעש חריג במידת הצורך. צייר מלבן סביב הנתיב הראשון באמצעות כלי בחירת המלבן ובחר אותו באמצעות הפקודה ניתוח, ג'לים ובחירת נתיב ראשון, או באמצעות קיצור המקשים. השתמש בעכבר כדי ללחוץ ולהחזיק באמצע המלבן בנתיב הראשון וגרור אותו לנתיב הבא.
עבור אל ניתוח, ג'לים ובחר הנתיב הבא. חזור על שלב זה עבור כל הנתיבים הנותרים. לאחר שכל הנתיבים מסומנים וממוספרים, עבור אל נתח, ג'לים ונתיבי עלילה כדי לצייר חלקת פרופיל של כל נתיב.
השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי למתוח קו לאורך הבסיס של כל פסגה, המתאים לכל רצועה, ומשמיט את רעשי הרקע. לאחר שכל הפסגות מכל נתיב נסגרו, בחרו בכלי השרביט ולחצו בתוך כל פסגה. יש לצוץ מדידות בחלון התוצאות עבור כל שיא מסומן.
שקול רק את פסגות 13S, 12S ו- 9S המתאימות ללהקות 631, 493 ו- 156 זוגות בסיסים. העתק נתוני עוצמה עבור עורך גיליון אלקטרוני וסכם את העוצמה מכל שלוש הרצועות עבור כל דגימה ולאחר מכן חשב את האחוז עבור כל איזופורם ביחס לסכום הכולל. התוויית האחוזים של כל איזופורם, או את ההבדלים באחוזים ביחס לדגימות שלא טופלו.
פלסמיד המכיל את המיני-דגן מ- E1A שימש כדי לבחון את ההשפעה על חבורת חלופית על ידי הערכת שיעור ה- mRNA מכל איזופורם המיוצר. ביטוי בזאלי של וריאנטים איזופורמים E1A היה תלוי בקו התא והשעה של ביטוי E1A. קו התא היציב HEK 293, או HEK 293 רקומבינאז המכיל אתר, הראה ביטוי גבוה יותר של 13S בהשוואה לתאי HeLa, אך הראה רמות דומות של isoforms 13S ו- 12S לאחר 48 שעות של ביטוי E1A.
תאים שנחשפו לציספלטין הראו שינוי בבחירת שיתוף ה-S-S הראשונית לטובת ביטוי 12S. אפקט זה נצפה HEK 293 ביציבות מבטא את הווקטור הריק דגל, כמו גם איזופורם אחד של Nek4. שינויים בהשתלבות חלופית לאחר טיפול paclitaxel היו דיסקרטיים מאוד, אבל הכיוונים של השינויים היו הפוכים פלאג ו Nek4 מבטא תאים.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בפקדי תמלול לא נגועים ולא הפוכים כדי למנוע פרשנות שגויה עם ביטוי E1A אנדוגני, בעיקר בעת שימוש בתאי HEK 293. לאחר קבלת תוצאות חיוביות, ניתן להעריך את ההשתתפות החלופית של גנים ספציפיים הקשורים לתגובה הכימותרפית. כאשר נצפתה השפעה מסוימת, פרוטוקול פשוט זה יכול לכוון מחקרים אלה למסלולים עקביים יותר, שבהם החלבון ממלא תפקיד בוויסות חיבור חלופי בתגובת כימותרפיה, למשל.
