سيساعد بروتوكولنا في الإجابة على تأثير تفاعلات الخلايا المناعية على وظائف الجزيرة. طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية يسمح لعلم وظائف الأعضاء الجزيرة ووظيفة لدراسة مع الحفاظ على الأنسجة الكامنة وراء الأمراض والبيئة الدقيقة الأصلية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على عمليات المرض لأمراض البنكرياس، مثل التهاب البنكرياس، ومرض السكري من النوع الأول، ومرض السكري من النوع الثاني.
للبدء، ترتيب الكتل على حامل العينة بطريقة لا تتجاوز عرض النصل، وضمان أن النصل يمكن أن تتحرك إلى الأمام أقل مسافة ممكنة عندما يتحرك هزاز ببطء. تطبيق خط من الغراء السوبر على حامل العينة، مما يجعل طبقة رقيقة باستخدام نهاية موزع الغراء، ثم الوجه كتل الأنسجة على الغراء بحيث الجانب القريب من الأنسجة يواجه صعودا. دفع بلطف أسفل الكتل والسماح للغراء الجاف لمدة ثلاث دقائق.
بعد ذلك ، قم بتوصيل اللوحة بالهزاز مع المسمار وضبط ارتفاع النصل والمسافة التي يتم قطعها بحيث يتحرك النصل على طول الكتل وبالكاد فوقها. دفع بلطف كتل مع ملقط للتأكد من أن الغراء قد جفت، ومن ثم ملء صينية هزاز مع محلول خارج الخلية المبردة حتى يتم تغطية النصل. تعيين هزاز لجعل شرائح من سمك 120 ميكرومتر والبدء فيه، ثم مراقبة شرائح الخروج من كتل الأنسجة.
رفع شرائح عندما تطفو قبالة كتلة عن طريق وضع فرشاة الطلاء أو ملقط تحتها ووضع شرائح في العازلة بيكربونات كريبس رينغر التي تحتوي على ثلاثة ملليمولار D-الجلوكوز ومثبطات تريبسين. ضع اللوحات التي تحتوي على الشرائح على الروك واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في 25 دورة في الدقيقة. إذا كانت الشرائح تحتاج إلى الاحتفاظ بها لفترة أطول، ضع الشرائح في 15 ملليلتر من شريحة الثقافة المتوسطة ووضع لوحة في حاضنة.
احتضان الشرائح المعدة في 37 درجة مئوية للدراسات في نفس اليوم أو نقل الشرائح التي يتم استزراعها في 24 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجربة. قم بتشغيل المجهر قبل ساعة واحدة على الأقل من التسجيل وتوازن حاضنة المرحلة العليا إلى 37 درجة مئوية. تأمين غطاء الزجاج أسفل طبق بيتري التي تحتوي على شريحة على خشبة المسرح.
ركز المجهر عن طريق وضع هدف 10X في وضع brightfield وحدد موقع الجزر باستخدام وضع الحقل الساطع من خلال البحث عن بيضاويات برتقالية اللون اللون داخل الشريحة. قم بتبديل المجهر إلى التصوير البؤري عن طريق الضغط على زر CS على وحدة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس بالمجهر. لعرض الجزر باستخدام العاكسة، قم بتشغيل كاشف الليزر 638 وكاشف PMT.
تعيين طاقة الليزر بين واحد و 2٪وإيقاف مرشحات الشق. استخدم ليزر 405 نانومتر وكاشف PMT لمراقبة بقعة الحمض النووي. الكاشف الهجين للكشف عن الأجسام المضادة CD8 وكاشف الليزر والهجين 488 نانومتر لعرض رباعي الأنسولين.
مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. بمجرد أن تقع جزيرة ذات أهمية ، قم بالتبديل إلى هدف 20X وتكبيرها بحيث تشغل الجزيرة معظم الإطار. اتخاذ z-كومة من الجزيرة، ثم العثور على أفضل المقاطع البصرية حيث إلى الخلايا على قيد الحياة وأي الخلايا المناعية المحيطة بها هي في التركيز.
قم بتعيين المجهر للتسجيل في وضع XYZT وتحسين الإعدادات لتسجيل كومة z من الخطوات المحددة كل 20 دقيقة على مدى عدة ساعات. تم تصور الجزر في شريحة أنسجة البنكرياس باستخدام برايتفيلد وعكس المجهر الخفيف. الأنسولين في الجزر يزيد من التفاصيل ويسبب امتصاص كميات كبيرة من الضوء المنعكس، مما يزيد من رؤية الجزر.
تم تقييم صلاحية شريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية عن طريق التلطيخ. ويشار إلى الخلايا الحية باللون الأخضر والخلايا الميتة باللون الأزرق. مؤشر إيجابي آخر لقابلية البقاء هو النشاط القاعدي الملحوظ.
عندما تم تحميل شريحة البنكرياس الحية مع مؤشر الكالسيوم نفاذية الخلية, لوحظ تحفيز الجلوكوز في كل من الماوس وشرائح البنكرياس البشري. كما تم قياس مضان الخلايا الفردية أثناء تحفيز الجلوكوز كميا. لوحظت الجزر السليمة والمرضى باستخدام تلطيخ dithizone وينعكس المجهر الخفيف.
الجزر المريضة تبدأ في فقدان الحبيبية بسبب تسلل الخلايا المناعية وموت الخلايا. يمكن التعرف على مجموعات الخلايا المناعية باستخدام الأجسام المضادة CD8 وتلطيخ رباعي الأنسولين. يشير التلطيخ المشترك إلى أن الخلايا هي خلية تي تأثيرية تستهدف على وجه التحديد مستضد الأنسولين.
الشيء الأكثر أهمية أن نتذكر في هذا الإجراء هو الحفاظ على شرائح في الحلول مثبطات بروتياز في جميع الأوقات. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء العديد من الوظائف في تجارب الخلايا المناعية مما يسمح بدراسة تأثير تفاعلات الخلايا المناعية ووظيفة الجزيرة.
