Il nostro protocollo aiuterà a rispondere all'impatto che le interazioni delle cellule immunitarie hanno sulla funzionalità delle isole. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo consente di studiare la fisiologia e la funzione delle isole mantenendo i tessuti alla base delle patologie e del microambiente nativo. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sui processi patologici delle malattie pancreatiche, come la pancreatite, il diabete di tipo I e il diabete di tipo II.
Per iniziare, disporre i blocchi sul supporto del campione in modo tale che non superino la larghezza della lama, assicurando che la lama possa spostarsi in avanti la minor distanza possibile quando il vibratoma si muove lentamente. Applicare una linea di super colla sul supporto del campione, creando uno strato sottile utilizzando l'estremità del distributore di colla, quindi capovolgere i blocchi di tessuto sulla colla in modo che il lato vicino al tessuto sia rivolto verso l'alto. Spingere delicatamente verso il basso i blocchi e lasciare asciugare la colla per tre minuti.
Quindi, fissare la piastra al vibratoma con una vite e regolare l'altezza e la distanza della lama percorse in modo che la lama si muova sulla lunghezza dei blocchi e appena sopra di essi. Spingere delicatamente i blocchi con la pinza per verificare che la colla si sia asciugata, quindi riempire il vassoio del vibratoma con una soluzione extracellulare refrigerata fino a quando la lama non è coperta. Impostare il vibratoma per fare fette di 120 micrometri di spessore e avviarlo, quindi osservare le fette che escono dai blocchi di tessuto.
Sollevare le fette quando galleggiano fuori dal blocco posizionando un pennello o una pinza sotto di esse e posizionare le fette in un tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente tre D-glucosio millimolare e inibitore della tripsina. Posizionare le piastre contenenti le fette su un bilanciere e incubare a temperatura ambiente per un'ora a 25 RPM. Se le fette devono essere conservate più a lungo, posizionare le fette in 15 millilitri di terreno di coltura a fette e posizionare il piatto in un'incubatrice.
Incubare le fette preparate a 37 gradi Celsius per studi nello stesso giorno o trasferire le fette coltivate a 24 gradi Celsius durante la notte a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima dell'esperimento. Accendere il microscopio almeno un'ora prima della registrazione ed equilibrare l'incubatore superiore del palco a 37 gradi Celsius. Fissare la capsula di Petri con fondo di vetro di copertura contenente la fetta sul palco.
Focalizzare il microscopio impostando l'obiettivo 10X in modalità campo luminoso e individuare le isole utilizzando la modalità campo luminoso cercando ovali di colore marrone arancione all'interno della fetta. Passare il microscopio all'imaging confocale premendo il pulsante CS sul controller touch screen del microscopio. Per visualizzare gli isolotti utilizzando la riflettanza, accendere il rilevatore laser 638 e il rilevatore PMT.
Impostare la potenza del laser tra uno e il 2% e spegnere i filtri notch. Utilizzare il laser a 405 nanometri e il rilevatore PMT per osservare la macchia di acido nucleico. Il rivelatore ibrido per il rilevamento degli anticorpi CD8 e il laser a 488 nanometri e il rilevatore ibrido per visualizzare il tetramero dell'insulina.
Centra l'isolotto di interesse nel campo visivo usando le manopole X e Y del controller dello stage. Una volta individuato un isolotto di interesse, passa all'obiettivo 20X e ingrandisci in modo che l'isolotto occupi la maggior parte dell'inquadratura. Prendi una z-stack dell'isolotto, quindi trova le migliori sezioni ottiche in cui le cellule sono vive e tutte le cellule immunitarie circostanti sono a fuoco.
Impostare il microscopio per registrare in modalità XYZT e ottimizzare le impostazioni per registrare uno z-stack dei passaggi selezionati ogni 20 minuti per un periodo di diverse ore. Le isole in una fetta di tessuto pancreatico sono state visualizzate utilizzando la microscopia a campo luminoso e a luce riflessa. L'insulina nelle isole aumenta la granularità e provoca l'assorbimento di grandi quantità di luce riflessa, aumentando la visibilità delle isole.
La vitalità di una fetta di tessuto pancreatico umano vivo è stata valutata mediante colorazione. Le cellule vive sono indicate in verde e le cellule morte in blu. Un altro indicatore positivo per la vitalità è l'attività basale osservabile.
Quando una fetta pancreatica viva è stata caricata con un indicatore di calcio permeabile alle cellule, la stimolazione del glucosio è stata osservata sia nelle fette pancreatiche di topo che in quelle umane. È stata anche quantificata la fluorescenza delle singole cellule durante la stimolazione del glucosio. Isole intatte e malate sono state osservate utilizzando la colorazione del ditizone e la microscopia a luce riflessa.
Le isole malate iniziano a perdere granularità a causa dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della morte cellulare. Le popolazioni di cellule immunitarie possono essere identificate utilizzando anticorpi CD8 e colorazione del tetramero dell'insulina. La co-colorazione indica che le cellule sono cellule T effettrici che mirano specificamente all'antigene dell'insulina.
La cosa più critica da ricordare in questa procedura è mantenere le fette in soluzioni inibitore della proteasi in ogni momento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire numerose funzionalità negli esperimenti sulle cellule immunitarie che consentono di studiare l'effetto delle interazioni delle cellule immunitarie e della funzione delle isole.
