私たちのプロトコルは、免疫細胞相互作用が小水機能に与える影響に答えるのに役立ちます。膵臓の生きた組織スライス法は、膵島の生理学と機能を研究しながら、基礎となる病理および天然の微小環境を維持することを可能にする。この方法は、膵炎、I型糖尿病、II型糖尿病などの膵臓疾患の疾患プロセスに関する洞察を提供する可能性があります。
まず、ブレード幅を超えないように、サンプルホルダーのブロックを配置し、ビブラートメがゆっくりと動いたときにブレードが可能な限り少ない距離で進むことができるようにします。標本ホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端を使用して薄い層を作り、組織ブロックを接着剤に反転させ、組織に近い側が上向きになるようにします。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。
次に、ねじでビブラートメにプレートを取り付け、ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上を移動するようにブレードの高さと距離を調整します。ブロックを鉗子で軽く動かして接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまで細胞外溶液でビブラートメトレイを満たします。ビブラートオムを120マイクロメートルの厚さのスライスを作り、それを開始し、その後、組織ブロックから外れるスライスを観察します。
彼らはそれらの下にペイントブラシや鉗子を配置することによってブロックから浮かぶときにスライスを持ち上げ、3ミリモルDグルコースとトリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液にスライスを置きます。スライスを含むプレートをロッカーに置き、室温で25RPMで1時間インキュベートします。スライスを長く保つ必要がある場合は、スライスを15ミリリットルのスライス培地に入れ、プレートをインキュベーターに入れる。
同じ日の研究のために摂氏37度で調製したスライスをインキュベートするか、実験の前に少なくとも1時間摂氏37度まで一晩で摂氏24度で培養されたスライスを移します。記録の少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に平衡化します。ステージ上のスライスを含むカバーガラス底ペトリ皿を固定します。
明視野モードで10Xの目標を設定して顕微鏡を焦点を当て、スライス内のオレンジ色の茶色の楕円形を探すことによって、明るいフィールドモードを使用して島を見つけます。顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率を使用して小島を表示するには、638レーザー検出器とPMT検出器をオンにします。
レーザーパワーを1~2%に設定し、ノッチフィルタをオフにします。405ナノメートルレーザーとPMT検出器を使用して、核酸染色を観察します。CD8抗体検出用のハイブリッド検出器と488ナノメートルレーザーおよびハイブリッド検出器はインスリン四量体を見る。
ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的の小地が見つかったら、20Xの目標に切り替えてズームインし、小子がフレームの大部分を占めます。小地のzスタックを取り、その後、細胞が生きていると任意の周囲の免疫細胞が焦点を当てている最高の光学セクションを見つけます。
XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定し、数時間の期間にわたって20分ごとに選択したステップのZスタックを記録するように設定を最適化します。膵臓組織スライス中の膵島を、明視野と反射光顕微鏡を用いて可視化した。小島のインスリンは粒度を増加させ、大量の反射光の吸収を引き起こし、小島の視認性を高める。
生きたヒト膵臓組織スライスの生存率を染色によって評価した。生細胞は緑色で示され、死んだ細胞は青で示されます。生存率のもう一つの肯定的な指標は、観察可能な基底活動である。
生きた膵スライスに細胞透過性カルシウム指標を積んだとき、マウスとヒトの両方の膵臓スライスでグルコース刺激が観察された。グルコース刺激時の個々の細胞の蛍光も定量化した。インタクトおよび病気の小島は、ジチゾン染色および反射光顕微鏡を用いて観察された。
病気の小島は、免疫細胞浸潤と細胞死のために粒度を失い始める。免疫細胞集団は、CD8抗体およびインスリン四量体染色を使用して同定することができる。共染色は、細胞がインスリン抗原を特異的に標的とするエフェクターT細胞であることを示す。
この手順で覚えておくべきことの最も重要なことは、溶液プロテアーゼ阻害剤のスライスを常に保持することです。この手順に従って、免疫細胞実験における多数の機能性を、免疫細胞相互作用および小子機能の効果を研究することを可能にすることができる。
