Notre protocole aidera à répondre à l’impact que les interactions des cellules immunitaires ont sur la fonctionnalité des îlots. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant permet d’étudier la physiologie et la fonction des îlots tout en maintenant les tissus sous-jacents aux pathologies et au microenvironnement natif. Cette méthode pourrait fournir un aperçu des processus pathologiques des maladies pancréatiques, telles que la pancréatite, le diabète de type I et le diabète de type II.
Pour commencer, disposez les blocs sur le porte-échantillon de manière à ce qu’ils ne dépassent pas la largeur de la lame, en veillant à ce que la lame puisse avancer le moins possible lorsque le vibratome se déplace lentement. Appliquez une ligne de super colle sur le porte-échantillon, en faisant une fine couche à l’aide de l’extrémité du distributeur de colle, puis retournez les blocs de tissu sur la colle de sorte que le côté proche du tissu soit orienté vers le haut. Poussez doucement les blocs et laissez la colle sécher pendant trois minutes.
Ensuite, fixez la plaque au vibratome avec une vis et ajustez la hauteur de la lame et la distance parcourue de sorte que la lame se déplace sur la longueur des blocs et à peine au-dessus d’eux. Poussez doucement les blocs avec la pince pour vérifier que la colle a séché, puis remplissez le plateau de vibratome avec une solution extracellulaire réfrigérée jusqu’à ce que la lame soit recouverte. Réglez le vibratome pour faire des tranches de 120 micromètres d’épaisseur et démarrez-le, puis observez les tranches qui sortent des blocs de tissu.
Soulevez les tranches lorsqu’elles flottent hors du bloc en plaçant un pinceau ou une pince en dessous d’elles et placez les tranches dans un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant trois millimolaires de D-glucose et un inhibiteur de la trypsine. Placez les plaques contenant les tranches sur une bascule et incubez à température ambiante pendant une heure à 25 tr/min. Si les tranches doivent être conservées plus longtemps, placez les tranches dans 15 millilitres de milieu de culture en tranches et placez la plaque dans un incubateur.
Incuber les tranches préparées à 37 degrés Celsius pour les études du jour même ou transférer les tranches qui sont cultivées à 24 degrés Celsius pendant la nuit à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant l’expérience. Allumez le microscope au moins une heure avant l’enregistrement et équilibrez l’incubateur supérieur de la scène à 37 degrés Celsius. Fixez le fond de Petri en verre contenant la tranche sur la scène.
Concentrez le microscope en réglant l’objectif 10X en mode champ lumineux et localisez les îlots en utilisant le mode champ lumineux en recherchant des ovales de couleur brun orangé dans la tranche. Basculez le microscope vers l’imagerie confocale en appuyant sur la touche CS du contrôleur à écran tactile du microscope. Pour visualiser les îlots à l’aide de la réflectance, allumez le détecteur laser 638 et le détecteur PMT.
Réglez la puissance laser entre un et 2% et éteignez les filtres à encoche. Utilisez le laser de 405 nanomètres et le détecteur PMT pour observer la coloration de l’acide nucléique. Le détecteur hybride pour la détection des anticorps CD8 et le laser de 488 nanomètres et le détecteur hybride pour visualiser le tétramère d’insuline.
Centrez l’îlot d’intérêt dans le champ de vision à l’aide des boutons X et Y du contrôleur de scène. Une fois qu’un îlot d’intérêt est localisé, passez à l’objectif 20X et zoomez pour que l’îlot occupe la majeure partie du cadre. Prenez une pile z de l’îlot, puis trouvez les meilleures sections optiques où les cellules sont vivantes et toutes les cellules immunitaires environnantes sont au centre de l’attention.
Réglez le microscope pour enregistrer en mode XYZT et optimisez les paramètres pour enregistrer une pile z des étapes sélectionnées toutes les 20 minutes sur une période de plusieurs heures. Les îlots d’une tranche de tissu pancréatique ont été visualisés à l’aide de la microscopie à fond clair et à lumière réfléchie. L’insuline dans les îlots augmente la granularité et provoque l’absorption de grandes quantités de lumière réfléchie, augmentant ainsi la visibilité des îlots.
La viabilité d’une tranche de tissu pancréatique humain vivant a été évaluée par coloration. Les cellules vivantes sont indiquées en vert et les cellules mortes en bleu. Un autre indicateur positif de la viabilité est l’activité basale observable.
Lorsqu’une tranche pancréatique vivante était chargée d’un indicateur de calcium perméable aux cellules, une stimulation du glucose était observée dans les tranches pancréatiques de souris et d’humains. La fluorescence des cellules individuelles pendant la stimulation du glucose a également été quantifiée. Des îlots intacts et malades ont été observés en utilisant la coloration à la dithizone et la microscopie à lumière réfléchie.
Les îlots malades commencent à perdre en granularité en raison de l’infiltration des cellules immunitaires et de la mort cellulaire. Les populations de cellules immunitaires peuvent être identifiées à l’aide d’anticorps CD8 et de la coloration tétramère d’insuline. La co-coloration indique que les cellules sont des lymphocytes T effecteurs qui ciblent spécifiquement l’antigène de l’insuline.
La chose la plus critique à retenir dans cette procédure est de garder les tranches dans des solutions d’inhibiteur de protéase à tout moment. Suite à cette procédure, de nombreuses fonctionnalités dans les expériences sur les cellules immunitaires peuvent être effectuées, ce qui permet d’étudier l’effet des interactions entre les cellules immunitaires et la fonction des îlots.
