우리의 프로토콜은 면역 세포 상호 작용이 islet 기능에 미치는 영향에 대답하는 데 도움이 될 것입니다. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 조직 생리학 및 기능을 연구할 수 있게 해 주며, 근본적인 병리및 기본 미세 환경을 유지한다. 이 방법은 췌장염, 타입-I 당뇨병 및 타입 II 당뇨병과 같은 췌장 병의 질병 프로세스에 대한 통찰력을 제공할 수 있었습니다.
먼저, 시편 홀더에 블록을 블레이드 너비를 초과하지 않는 방식으로 정렬하여 진동이 느리게 움직일 때 블레이드가 가능한 최소 거리를 앞으로 이동할 수 있도록 합니다. 시편 홀더에 슈퍼 접착제 라인을 적용하여 접착제 디스펜서의 끝을 사용하여 얇은 층을 만든 다음 조직 블록을 접착제에 뒤집어 조직에 가까운 측면이 위쪽으로 향하도록 합니다. 블록을 부드럽게 밀어 3 분 동안 접착제를 건조하게.
다음으로, 나사로 진동에 접시를 부착하고 블레이드가 블록의 길이를 넘어 겨우 그 위에 움직일 수 있도록 이동중인 블레이드 높이와 거리를 조정합니다. 덩어리를 집게로 부드럽게 움직여 접착제가 건조되었는지 확인한 다음, 블레이드가 덮일 때까지 차가운 세포 외 용액으로 진동 트레이를 채웁니다. 진동을 설정하여 120 마이크로미터 두께의 슬라이스를 만들고 시작한 다음 조직 블록에서 나오는 조각을 관찰합니다.
페인트브러시나 집게를 아래에 놓고 블록에서 부동할 때 슬라이스를 들어 올리고, 3밀리몰러 D-포도당과 트립신 억제제를 함유한 크렙스 링거 중탄산염 버퍼에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스가 들어 있는 플레이트를 로커에 놓고 실온에서 25RPM에서 1시간 동안 배양합니다. 슬라이스를 더 오래 보관해야 하는 경우 슬라이스를 슬라이스 배양 배지 의 15 밀리리터에 놓고 접시를 인큐베이터에 놓습니다.
같은 날 의 연구를 위해 37°C의 준비된 슬라이스를 배양하거나 실험 전 최소 한 시간 동안 섭씨 24도에서 섭씨 37도로 배양되는 슬라이스를 이송한다. 기록 하기 전에 적어도 한 시간 현미경을 전환 하 고 37 섭씨 37 도 무대 상단 인큐베이터를 평형. 무대의 슬라이스가 들어 있는 커버 글래스 하단 페트리 접시를 고정합니다.
브라이트필드 모드에서 10X 목표를 설정하여 현미경에 초점을 맞추고 슬라이스 내에서 주황색 갈색 타원형을 찾아 밝은 필드 모드를 사용하여 섬을 찾습니다. 현미경의 터치 스크린 컨트롤러에 CS 버튼을 눌러 현미경을 공초점 이미징으로 전환합니다. 반사도를 사용하여 섬을 보려면 638 레이저 검출기 및 PMT 검출기를 켭니다.
레이저 전원을 1~2% 설정하고 노치 필터를 끕니다. 405 나노미터 레이저 및 PMT 검출기를 사용하여 핵산 얼룩을 관찰한다. CD8 항체 검출및 488 나노미터 레이저 및 하이브리드 검출기를 위한 하이브리드 검출기는 인슐린 테트라머를 볼 수 있다.
스테이지 컨트롤러의 X 및 Y 노브를 사용하여 시야에 관심 있는 별의 중심을 이용하여 센터. 관심 있는 것이 있으면 20X 목표로 전환하고 확대하여 이 점은 프레임의 대부분을 차지합니다. 아일렛의 z 스택을 가지고, 다음 세포가 살아 있고 모든 주변 면역 세포가 초점을 맞추고있는 최고의 광학 섹션을 찾을 수 있습니다.
현미경을 XYZT 모드에서 기록하도록 설정하고 설정을 최적화하여 몇 시간 동안 20분마다 선택한 단계의 z 스택을 기록합니다. 췌장 조직 조각의 섬은 밝은 필드를 사용하여 시각화하고 빛 현미경 을 반사했다. 섬내 인슐린은 세분성을 증가시키고 다량의 반사된 빛의 흡수를 일으켜 섬의 가시성을 증가시킨다.
살아있는 인간 췌장 조직 조각의 생존성은 염색에 의해 평가되었습니다. 살아있는 세포는 녹색으로 표시되고 죽은 세포는 파란색으로 표시됩니다. 생존가능성에 대한 또 다른 긍정적인 지표는 관찰 가능한 기초 활동입니다.
살아있는 췌장 슬라이스가 세포 투과성 칼슘 지표로 로드되었을 때, 포도당 자극은 마우스와 인간 췌장 조각 모두에서 관찰되었다. 포도당 자극 중 개별 세포의 형광도 정량화되었다. 손상되지 않은 병은 디티존 염색 및 반사된 광 현미경 검사를 사용하여 관찰되었다.
병에 걸린 섬은 면역 세포 침투 및 세포 죽음 때문에 세분성을 잃기 시작합니다. 면역 세포 인구는 CD8 항체 및 인슐린 테트라머 염색을 사용하여 확인할 수 있습니다. 공동 염색은 세포가 인슐린 항원을 구체적으로 표적으로 하는 이펙터 T 세포임을 나타낸다.
이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 항상 용액 프로테아제 억제제에 슬라이스를 유지하는 것입니다. 이 절차에 따라 면역 세포 실험에 있는 수많은 기능은 면역 세포 상호 작용및 아슬렛 기능의 효력을 공부할 수 있도록 수행될 수 있습니다.
