Protokolümüz, bağışıklık hücresi etkileşimlerinin adacık işlevselliği üzerindeki etkisini yanıtlamaya yardımcı olacaktır. Canlı pankreas doku dilimi yöntemi, patolojilerin ve doğal mikroçevrenin altında kalan dokuların korunması sırasında adacık fizyolojisinin ve işlevinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem pankreatit, tip I diyabet ve tip II diyabet gibi pankreas hastalıklarının hastalık süreçleri hakkında fikir verebilir.
Başlamak için, numune tutucusun üzerindeki blokları bıçak genişliğini aşmayacak şekilde düzenleyin, vibratom yavaşça hareket ettiğinde bıçağın mümkün olan en az mesafeyi ilerleyebilmesini sağlayın. Numune tutucusuna bir süper tutkal hattı uygulayın, tutkal dağıtıcısının ucunun ucunun kullanılarak ince bir tabaka haline getirilir, ardından doku bloklarını yapıştırıcıya çevirin, böylece dokuya yakın taraf yukarı doğru yüzler. Blokları yavaşça aşağı itin ve tutkalın üç dakika kurumasına izin verin.
Daha sonra, plakayı vibratome bir vida ile takın ve bıçak yüksekliğini ve kat edilen mesafeyi, bıçağın blokların uzunluğu üzerinde ve hemen üstünde hareket etmesi için ayarlayın. Tutkalın kuruduğunu kontrol etmek için blokları forsepslerle hafifçe iteleyin ve ardından vibratom tepsisini bıçak kaplanana kadar soğutulmuş hücre dışı bir çözelti ile doldurun. Vibratomu 120 mikrometre kalınlığında dilimler yapacak şekilde ayarlayın ve başlatın, ardından doku bloklarından çıkan dilimleri gözlemleyin.
Altına bir boya fırçası veya tokalar yerleştirerek bloktan yüzdüklerinde dilimleri kaldırın ve dilimleri üç milimoler D-glikoz ve tripsin inhibitörü içeren Krebs-Ringer bikarbonat tampona yerleştirin. Dilimleri içeren tabakları bir rocker üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 25 RPM'de bir saat kuluçkaya yaslayın. Dilimlerin daha uzun süre tutulması gerekiyorsa, dilimleri 15 mililitre dilim kültürü ortamına yerleştirin ve plakayı bir inkübatöre yerleştirin.
Hazırlanan dilimleri aynı gün çalışmaları için 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın veya bir gecede 24 santigrat derecede kültüre edilen dilimleri deneyden önce en az bir saat boyunca 37 santigrat dereceye aktarın. Kayıtten en az bir saat önce mikroskobu aç ve sahne üst inkübatörü 37 santigrat dereceye kadar dengele. Sahnedeki dilimi içeren kapak cam alt Petri kabını sabitleyin.
Parlak alan modunda 10X hedefini ayarlayarak mikroskobu odakla ve dilim içinde turuncu kahverengi renkli ovaller arayarak parlak alan modunu kullanarak adacıkları bulun. Mikroskopun dokunmatik ekran denetleyicisindeki CS düğmesine basarak mikroskobu konfokal görüntülemeye geçirin. Adacıkları yansıtıcı kullanarak görüntülemek için 638 lazer dedektörünü ve PMT dedektörünü açın.
Lazer gücünü %1 ile %2 arasında ayarlayın ve çentik filtrelerini kapatın. Nükleik asit lekesini gözlemlemek için 405 nanometre lazer ve PMT dedektörünü kullanın. CD8 antikor tespiti için hibrit dedektör ve insülin tetramerini görüntülemek için 488 nanometre lazer ve hibrit dedektör.
Sahne alanı denetleyicisinin X ve Y düğmelerini kullanarak görüş alanındaki ilgi adacını ortaleyin. Bir ilgi adacık bulunduğunda, 20X hedefine geçin ve adacık çerçevenin çoğunu kaplasın diye yakınlaştırın. Adacıktan bir z yığını alın, ardından hücrelerin canlı olduğu ve çevredeki bağışıklık hücrelerinin odaklandığı en iyi optik bölümleri bulun.
Mikroskobu XYZT modunda kaydedecek şekilde ayarlayın ve birkaç saatlik bir süre boyunca her 20 dakikada bir seçilen adımların z yığınını kaydetmek için ayarları optimize edin. Pankreas dokusu dilimindeki adacıklar brightfield kullanılarak görselleştirildi ve ışık mikroskopisi yansıtıldı. Adacıklardaki insülin tanecikleri arttırır ve büyük miktarlarda yansıyan ışığın emilimine neden olarak adacıkların görünürlüğünü arttırır.
Canlı bir insan pankreas doku diliminin uygulanabilirliği lekelenerek değerlendirildi. Canlı hücreler yeşil, ölü hücreler ise mavi ile gösterilir. Canlılık için bir başka olumlu gösterge de gözlemlenebilir bazal aktivitedir.
Canlı bir pankreas dilimine hücre geçirgen kalsiyum göstergesi yüklendiğinde, hem fare hem de insan pankreas dilimlerinde glikoz stimülasyonu gözlendi. Glikoz stimülasyonu sırasında tek tek hücrelerin floresanları da ölçüldü. Dithizone boyama ve yansıyan ışık mikroskopisi kullanılarak sağlam ve hastalıklı adacıklar gözlendi.
Hastalıklı adacıklar bağışıklık hücresine sızma ve hücre ölümü nedeniyle taneciklerini kaybetmeye başlar. Bağışıklık hücresi popülasyonları CD8 antikorları ve insülin tetramer lekeleme kullanılarak tanımlanabilir. Birlikte boyama, hücrelerin özellikle insülin antijenini hedef alan efektör T hücresi olduğunu gösterir.
Bu prosedürde hatırlanması gereken en kritik şey, dilimleri her zaman çözelti proteaz inhibitöründe tutmaktır. Bu işlemden sonra, immün hücre etkileşimlerinin ve adacık fonksiyonunun etkisinin incelenmesini sağlayan bağışıklık hücresi deneylerinde çok sayıda işlevsellik yapılabilir.
