Наш протокол поможет ответить на влияние, которое иммунные клеточные взаимодействия оказывают на функциональность островков. Метод среза живой ткани поджелудочной железы позволяет изучать физиологию и функцию островков при сохранении тканей, лежащих в основе патологий, и нативной микросреды. Этот метод может дать представление о болезненных процессах заболеваний поджелудочной железы, таких как панкреатит, диабет I типа и диабет II типа.
Для начала расположите блоки на держателе образца таким образом, чтобы они не превышали ширину лезвия, гарантируя, что лезвие может двигаться вперед на минимально возможное расстояние, когда вибратом движется медленно. Нанесите линию суперклея на держатель образца, сделав тонкий слой с помощью конца дозатора клея, затем переверните блоки тканей на клей так, чтобы сторона, близкая к ткани, была обращена вверх. Аккуратно надавите на блоки и дайте клею высохнуть в течение трех минут.
Затем прикрепите пластину к вибратому с помощью винта и отрегулируйте высоту и расстояние, которое перемещается так, чтобы лезвие двигалось по длине блоков и чуть выше них. Осторожно подталкивайте блоки щипцами, чтобы убедиться, что клей высох, а затем заполните лоток вибратома охлажденным внеклеточным раствором, пока лезвие не будет покрыто. Установите вибратом, чтобы сделать срезы толщиной 120 микрометров и запустите его, затем наблюдайте за срезами, отрывающимися от тканевых блоков.
Поднимите ломтики, когда они выплывают из блока, поместив под них кисть или щипцы, и поместите ломтики в бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий три миллимоляра D-глюкозы и ингибитор трипсина. Поместите пластины, содержащие ломтики, на коромысл и инкубируйте при комнатной температуре в течение часа при 25 оборотах в минуту. Если ломтики нужно хранить дольше, поместите ломтики в 15 миллилитров ломтик-культуральной среды и поместите пластину в инкубатор.
Инкубируйте подготовленные ломтики при 37 градусах Цельсия для исследований в тот же день или перенесите ломтики, которые культивируются при 24 градусах Цельсия в течение ночи, до 37 градусов Цельсия в течение по крайней мере одного часа до эксперимента. Включите микроскоп по крайней мере за час до записи и уравновесьте верхнюю часть инкубатора до 37 градусов Цельсия. Закрепите на сцене стеклянную нижнюю чашку Петри, содержащую ломтик.
Сфокусируйте микроскоп, установив объектив 10X в режиме яркого поля, и найдите островки в режиме яркого поля, выполнив поиск оранжево-коричневых овалов внутри среза. Переключите микроскоп на конфокальную визуализацию, нажав кнопку CS на контроллере сенсорного экрана микроскопа. Для просмотра островков с использованием отражательной способности включите лазерный детектор 638 и детектор PMT.
Установите мощность лазера от одного до 2% и выключите выемчатые фильтры. Используйте 405-нанометровый лазер и детектор PMT для наблюдения за окрашиванием нуклеиновых кислот. Гибридный детектор для обнаружения антител CD8 и 488-нанометровый лазерный и гибридный детектор для просмотра тетрамера инсулина.
Центрируйте интересующий островок в поле зрения с помощью ручек X и Y контроллера сцены. Как только интересующий островок будет найден, переключитесь на цель 20X и увеличьте масштаб, чтобы островок занимал большую часть кадра. Возьмите z-стек островка, затем найдите лучшие оптические участки, где клетки живы и любые окружающие иммунные клетки находятся в фокусе.
Установите микроскоп для записи в режиме XYZT и оптимизируйте настройки для записи z-стека выбранных шагов каждые 20 минут в течение нескольких часов. Островки в срезе ткани поджелудочной железы были визуализированы с использованием микроскопии яркого поля и отраженного света. Инсулин в островках увеличивает зернистость и вызывает поглощение большого количества отраженного света, увеличивая видимость островков.
Жизнеспособность живого среза ткани поджелудочной железы человека оценивали путем окрашивания. Живые клетки обозначены зеленым цветом, а мертвые клетки — синим. Еще одним положительным показателем жизнеспособности является наблюдаемая базальная активность.
Когда живой срез поджелудочной железы был загружен клеточным проницаемым индикатором кальция, стимуляция глюкозой наблюдалась как в мышиных, так и в человеческих срезах поджелудочной железы. Флуоресценция отдельных клеток во время стимуляции глюкозой также была количественно определена. Интактные и больные островки наблюдались с помощью окрашивания дитизоном и микроскопии отраженного света.
Больные островки начинают терять зернистость из-за инфильтрации иммунных клеток и гибели клеток. Популяции иммунных клеток могут быть идентифицированы с помощью антител CD8 и окрашивания тетрамера инсулина. Совместное окрашивание указывает на то, что клетки являются эффекторными Т-клетками, которые специфически нацелены на антиген инсулина.
Самое важное, что нужно помнить в этой процедуре, это постоянно держать срезы в растворах ингибитора протеазы. После этой процедуры могут быть выполнены многочисленные функциональные возможности в экспериментах с иммунными клетками, позволяющие изучить влияние взаимодействия иммунных клеток и функцию островков.
