Nosso protocolo ajudará a responder o impacto que as interações com células imunes têm na funcionalidade da ilhota. O método de fatia de tecido pancreático vivo permite que a fisiologia e a função da ilhota sejam estudadas, mantendo os tecidos subjacentes às patologias e ao microambiente nativo. Esse método poderia fornecer insights sobre os processos da doença de doenças pancreáticas, como pancreatite, diabetes tipo I e diabetes tipo II.
Para começar, organize os blocos no suporte da amostra de forma que eles não excedam a largura da lâmina, garantindo que a lâmina possa mover para a frente a distância menos possível quando o vibratome se mover lentamente. Aplique uma linha de super cola no suporte da amostra, fazendo uma camada fina usando a extremidade do distribuidor de cola, em seguida, vire os blocos de tecido sobre a cola para que o lado próximo ao tecido fique virado para cima. Empurre suavemente os blocos e deixe a cola secar por três minutos.
Em seguida, conecte a placa ao vibratome com um parafuso e ajuste a altura e distância da lâmina que está sendo percorrida para que a lâmina se mova sobre o comprimento dos blocos e apenas pouco acima deles. Empurre suavemente os blocos com os fórceps para verificar secar a cola e, em seguida, encha a bandeja de vibratome com uma solução extracelular resfriada até que a lâmina esteja coberta. Coloque o vibratome para fazer fatias de 120 micrômetros de espessura e inicie-o, em seguida, observe as fatias saindo dos blocos de tecido.
Levante as fatias quando flutuarem para fora do bloco colocando um pincel ou fórceps abaixo delas e coloque as fatias no tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo três milimães de glicose D e inibidor de trypsina. Coloque as placas contendo as fatias em um roqueiro e incubar em temperatura ambiente por uma hora a 25 RPM. Se as fatias precisarem ser mantidas por mais tempo, coloque as fatias em 15 mililitros de cultura de fatia e coloque a placa em uma incubadora.
Incubar as fatias preparadas a 37 graus Celsius para estudos no mesmo dia ou transferir as fatias que são cultivadas a 24 graus Celsius durante a noite para 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do experimento. Ligue o microscópio pelo menos uma hora antes da gravação e equilibre a incubadora superior do palco para 37 graus Celsius. Fixar a placa de vidro de vidro de cobertura contendo a fatia no palco.
Concentre o microscópio definindo o objetivo de 10X no modo brightfield e localize as ilhotas usando o modo de campo brilhante procurando ovais cor-de-laranja dentro da fatia. Mude o microscópio para imagens confocal, pressionando o botão CS no controlador de tela de toque do microscópio. Para ver as ilhotas usando reflectância, ligue o detector de laser 638 e o detector PMT.
Defina a potência do laser entre um e 2% e desligue os filtros de entalhe. Use o laser de 405 nanômetros e o detector PMT para observar a mancha de ácido nucleico. O detector híbrido para a detecção de anticorpos CD8 e o laser de 488 nanômetros e detector híbrido para visualizar o tetramer de insulina.
Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez localizada uma ilhota de interesse, mude para o objetivo de 20X e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro. Pegue uma pilha de z da ilhota, então encontre as melhores seções ópticas onde as células estão vivas e todas as células imunes circundantes estão em foco.
Defina o microscópio para gravar no modo XYZT e otimize as configurações para gravar uma pilha de z das etapas selecionadas a cada 20 minutos durante um período de várias horas. As ilhotas em uma fatia de tecido pancreático foram visualizadas usando campo brilhante e microscopia de luz refletida. A insulina nas ilhotas aumenta a granularidade e causa absorção de grandes quantidades de luz refletida, aumentando a visibilidade das ilhotas.
A viabilidade de uma fatia de tecido pancreático humano vivo foi avaliada pela coloração. As células vivas são indicadas em verde e as células mortas em azul. Outro indicador positivo para viabilidade é a atividade basal observável.
Quando uma fatia pancreática viva foi carregada com um indicador de cálcio permeável celular, a estimulação de glicose foi observada em fatias de camundongos e pancreáticos humanos. A fluorescência de células individuais durante a estimulação da glicose também foi quantificada. Ilhotas intactas e doentes foram observadas utilizando-se manchas de dithizone e microscopia de luz refletida.
As ilhotas doentes começam a perder granularidade devido à infiltração de células imunes e morte celular. Populações de células imunes podem ser identificadas usando anticorpos CD8 e coloração de tetramer de insulina. A co-coloração indica que as células são efeitos ou células T que estão especificamente mirando o antígeno de insulina.
A coisa mais crítica a ser lembrada neste procedimento é manter as fatias em soluções inibidoras de protease o tempo todo. Após esse procedimento, inúmeras funcionalidades em experimentos com células imunes podem ser realizadas permitindo que o efeito das interações com células imunes e a função de ilhotas sejam estudados.
