نحن نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الإكسوسومات من الدرجة GMP من الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي باستخدام مفاعلنا الحيوي 3D. يمكن استخدام هذه الإكسوسومات في أبحاث بيولوجيا الإكسوسوم وعلاج التهاب المفاصل السريري. سيتم عرض الإجراء الدكتور يوجي ليانغ.
ابدأ في جمع الخلايا الوسيطة البشرية ، أو MSCs ، عن طريق الطرد المركزي للسائل الزليلي عند 1،500 مرة من G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة الخلية ب 10 ملليلتر من PBS. قم بالطرد المركزي للخلايا المعاد تعليقها عند 1،500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من PBS قبل إعادة تعليق الكريات ب 10 ملليلتر من وسط ثقافة MSC البشري بكثافة خلية تبلغ خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر ثم قم بطلاء التعليق في طبق 100 ملم.
احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد أسبوعين ، اجمع السوبرناتانت المزروع الخلوي لتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي ، أو SF-MSCs ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. للقيام بذلك ، قم بهضم الجيل الثالث من مرور ثلاثة من SF-MSCs عن طريق الطرد المركزي عند 1000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم ، تخلص من supernatant قبل جمع بيليه الخلية. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى حبيبة الخلية بتركيز خمسة أضعاف 10 إلى الرابع واسمح للحبيبة بالوقوف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية كما هو موضح سابقا ، ثم أعد تعليق الكريات المنفصلة في 100 ميكرولتر من 1X PBS.
أضف ميكرولتر واحد من الجسم المضاد الفلوري أحادي النسيلة بنسبة تخفيف 1:100 لكل أنبوب كما هو موضح في المخطوطة ، وضع الأنبوب للحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1X PBS وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1X PBS. بعد ذلك ، اكتشف الفلوروفورات في ما يصل إلى 10000 خلية على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات الحمراء وقنوات FITC.
لإعداد الناقلات الدقيقة ، قم بنفخ وترطيب 0.75 جرام جاف من الناقلات الدقيقة في 1X DPBS بتركيز 50 ملليغرام لكل جرام لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم ، صب supernatant لغسل microcarriers في DPBS جديدة لمدة خمس دقائق. بعد استبدال الوسط ب 1X DPBS طازج عند 50 ملليغرام من الناقلات الدقيقة لكل غرام ، قم بتعقيم الناقلات الدقيقة عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 15 رطلا لكل بوصة مربعة.
ثم ، اسمح للناقلات الدقيقة المعقمة بالاستقرار قبل صب السوبرناتانت. شطف الناقلات الدقيقة في وسط الثقافة بتركيز 50 ملليغرام من الناقلات الدقيقة لكل غرام في درجة حرارة الغرفة. عندما يتم تسوية الناقلات الدقيقة ، تخلص من supernatant.
لإعداد المفاعل الحيوي التروية ، قم بتعقيم المفاعل الحيوي عن طريق التعقيم كما هو موضح سابقا. عند الانتهاء، احسب عدد SF-MSCs لتخصيص 2.5 في 10 إلى SF-MSCs السابع والناقلات الدقيقة إلى المفاعل الحيوي الذي يتم تشغيله مع 250 ملليلتر من وسط استزراع MSC من فئة GMP. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بسرعة 15 دورة في الدقيقة.
تغيير الوسط الثقافي كل ستة أيام. بعد 14 يوما ، اجمع الخارقين لزراعة الخلايا والناقلات الدقيقة لمزيد من التحليل. الطرد المركزي لمزرعة الخلايا الفائقة في 300 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وجمع supernatant مع التخلص من الحطام الخلوي.
عند أربع درجات مئوية ، قم بالطرد المركزي بالتتابع للجهاز الفائق عند 2،000 مرة G لمدة 10 دقائق ثم في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة للتخلص من الحويصلات الأكبر وجمع الكريات. بعد تعليق الكريات في 40 ملليلتر من PBS ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 120،000 مرة G لمدة 70 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم ، أعد تعليق الكريات التي تم جمعها والتي تحتوي على إكسوسومات في 500 ميكرولتر من PBS.
قم بتخفيف عينات الإكسوسوم المعزولة حديثا باستخدام PBS المعقمة إلى تركيز 10 إلى السابع إلى 10 إلى الجسيمات التاسعة لكل ملليلتر وحقن 500 ميكرولتر من العينة لكل منها في تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو نظام NTA ، عند 30 ميكرولتر في الدقيقة و 24.4 إلى 24.5 درجة مئوية. اضبط نظام الالتقاط والتحليل يدويا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تصور الجسيمات عن طريق تشتت ضوء الليزر والتقاط حركتها البراونية على الفيديو الرقمي.
بعد ذلك ، قم بتحليل أشرطة الفيديو المسجلة باستخدام البرنامج ، وتتبع ما لا يقل عن 200 جسيم فردي لكل تشغيل. بالنسبة للنشاف الغربي ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني إلى الإكسوسومات مع الخلط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم ، اسمح للوقوف على الجليد لمدة 20 دقيقة.
بعد الطرد المركزي للخليط عند 9،391 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بقياس تركيز البروتين في supernatant باستخدام مجموعة فحص البروتين. بعد الفحص ، قم بتسخين العينة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل البروتين 4X عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتحميل 15 ميكرولتر من البروتينات بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر لتشغيلها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي عند 120 فولت لمدة 70 دقيقة ، والنشاف الكهربائي عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
اكتشف العلامات المحددة غير الإكسوسومية ، مثل الكالنكسين والمؤشرات الحيوية الخارجية مثل CD9 و CD63 و CD81 عن طريق النشاف الغربي الفلورسنت. في الدراسة ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد العلامات السطحية ل SF-MSCs. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن SF-MSCs المستزرعة كانت سلبية ل CD34 و CD45 و HLA-DR ، وإيجابية ل CD73 و CD90 و CD105 ، مستوفية لمعايير تحديد MSCs.
تحت المجهر المقلوب ، لوحظ أن SF-MSCs تنتشر على الناقلات الدقيقة. انتشرت SF-MSC في ثقافة 3D بسرعة أكبر من ستة أيام فصاعدا مقارنة بثقافة 2D. تم تحديد الإكسوسومات من SF-MSCs من ثقافة 2D و 3D باستخدام النشاف الغربي ووجد أن الإكسوسومات تعبر عن CD63 و CD9 و CD81 بينما تكون سلبية للكالنكسين.
أظهر تحليل الخلايا النانوية أن قطر الإكسوسومات 2D و 3D كان حوالي 120 نانومتر. كشف التحليل المجهري الإلكتروني للانتقال عن مورفولوجيا الإكسوسومات 2D و 3D ، مما يدل على الحويصلات الكروية تقريبا. باستخدام تحليل NTA ، تم تحليل تركيز الجسيمات بحجم 30 إلى 160 نانومتر.
بعد الثقافة ثلاثية الأبعاد ، كان تركيز الجسيمات 4.0 مرات 10 إلى ستة لكل ملليلتر. ومع ذلك ، بعد ثقافة 2D ، كان تركيز الجسيمات بنفس الحجم 2.5 مرة 10 إلى ستة لكل ملليلتر. علاوة على ذلك ، أنتجت ثقافة 3D بروتينا خارجيا أكثر من ثقافة 2D.
يظهر التحليل التمثيلي استيعاب الإكسوسومات التي تحمل علامة ديل بواسطة الخلايا الغضروفية الأولية. يمكن رؤية الإكسوسومات التي تحمل علامة ديل والتي دخلت الخلايا الغضروفية الأولية مع ذروة في ثلاث ساعات. أظهرت دراسة التسليم في المختبر أن الإكسوسومات يمكن أن توصل السلفو سيانين3 microRNA-140 المسمى بالسلو إلى الخلايا الغضروفية.
إن طلاء الخلايا ، وبدء التفاعل في المفاعل الحيوي ، و supernatant هي أهم الخطوات في هذا البروتوكول. تستخدم ثقافة 3D بشكل شائع للزراعة واسعة النطاق للخلايا الملتصقة. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مثل spin flex لإنتاج الإكسوسومات على نطاق واسع.
تعمل طريقتنا على تحسين إنتاجية الإكسوسومات ، وبالتالي تمكين التطبيق قبل السريري القائم على MSC exosome.
