Organoids هي قوية في تكنولوجيا المختبر المستخدمة لفحص المخدرات وفهم العمليات البيولوجية. لذلك ، فإن توليد الأجهزة العضوية التي نموذج اللسان أمر بالغ الأهمية لدراسة تطور خلية الذوق وتجديدها. يمكن أن تكون الدراسات التقليدية في الذوق الحي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا.
يقدم هذا البروتوكول العضوي بديلا موحدا قابلا للاستنساخ يقلل من تلك التحديات مع السماح بتجارب إنتاجية أعلى. بعد القتل الرحيم فأرة الكبار، استخدم مقص تشريح معقم كبير لقطع الخدين وكسر الفك. ثم ارفع اللسان وقطع الفرينوم اللغوي لفصل اللسان عن أرضية التجويف الفموي.
قطع اللسان وجمعه في dPBS الجليد الباردة العقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تحت المجهر تشريح، وإزالة والتخلص من اللسان الأمامي عن طريق قطع فقط الأمامية من سماحة بين مالار مع شفرة حلاقة. ثم باستخدام مسح مهمة حساسة لإزالة أي شعر والسائل الزائد من اللسان الخلفي.
بعد ذلك، ملء حقنة ملليلتر واحد مع 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن وإدراج إبرة نصف بوصة قياس 30 فقط فوق سماحة بين الملار حتى مجرد الأمامي من الحليمة circumvallate، أو CVP. حقن محلول الانزيم تحت وعلى الحواف الجانبية للCVP بين الظهارة والأنسجة الكامنة. سحب الحقنة ببطء وباستمرار من اللسان كما يتم حقن الحل.
احتضان اللسان والكالسيوم المعقم خالية من المغنيسيوم dPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة على وجه التحديد. باستخدام مقص تشريح خارج غرامة، وجعل تخفيضات صغيرة في الظهارة ثنائيا وفقط الأمامية من CVP. ثم قشر بلطف الظهارة عن طريق رفعه مع ملقط غرامة.
بمجرد أن تكون ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعه في أنبوبين ميكروسينتر الطرد المركزي ملليلتر ، المغلفة مسبقا مع FBS. أضف كوكتيل إنزيم التفكك إلى الأنابيب التي تحتوي على ظهارة CVP المقشرة واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 15 دقيقة. خلال الدقائق ال 15 الأخيرة من الحضانة، قبل الحرب 0.25٪ تريبسين-EDTA في حمام الماء.
بعد الحضانة، دوامة الأنابيب في triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة دقيقة واحدة. بعد قطع الأنسجة تسوية، ماصة supernatant تحتوي على المجموعة الأولى من الخلايا المفككة في FBS جديدة مغلفة أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر. تدور supernatant لمدة خمس دقائق في 370 مرة G وأربع درجات مئوية لبيليه الخلايا.
إزالة supernatant الناتجة، ثم resuspend بيليه الخلية في العازلة FACS ويبقيه على الجليد. لتفكيك قطع الأنسجة المتبقية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق الأصلية مليلتر، إضافة مسبقا 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 10 دقائق. ثم، تريتورات قطع الأنسجة مع ماصة باستور الزجاج لمدة دقيقة واحدة.
بعد أن تستقر قطع الأنسجة ، قم بتنقية الماصة الفائقة في أنابيب الطرد الدقيق 1.5 ملليلتر التي تحتوي على الخلايا المفككة التي تم جمعها سابقا في العازلة FACS. تدور الأنابيب مع الخلايا المفككة. بعد إزالة supernatant، resuspend الكريات الخلية في العازلة FACS والاحتفاظ بها على الجليد.
ثم قم بعزل الخلايا الإيجابية Lgr5-GFP عبر FACS باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر كما هو موضح في مخطوطة النص. نقل العدد المطلوب من Lgr5 الخلايا المعلقة إيجابية في أنبوب جديد microcentrifuge. تدور الأنبوب لمدة خمس دقائق في 370 مرة G وأربع درجات مئوية لبيليه الخلايا.
إزالة supernatant ووضع الأنبوب على الجليد. إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في الكمية المناسبة من هلام مصفوفة مع pipetting لطيف. ثم احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لمنع هلام المصفوفة من التبلور.
إضافة 15 ميكرولتر من هلام مصفوفة في خليط الخلية في وسط كل بئر من لوحة 48 جيدا. لضمان توزيع الخلايا حتى، اخلطي جل المصفوفة وخليط الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بعد طلاء كل ثلاثة آبار. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون و95٪ رطوبة لمدة 10 دقائق للسماح بجل المصفوفة.
ثم، إضافة 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة WENRAS وسائل الإعلام تكملها مع مثبط الصخور، Y27632، إلى كل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة. بعد يومين من الطلاء، قم بإزالة الوسائط من كل بئر باستخدام ماصة ملليلتر واحد أو عن طريق الشفط الفراغي، مما يضمن عدم وجود تلوث متقاطع بين الظروف. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام WENRAS أسفل الجانب من البئر، مع الحرص على عدم تعطيل هلام مصفوفة وإعادة لوحة إلى الحاضنة.
عندما يتم استزراع الأجهزة اللغوية باستخدام وسائط WENR ، فإنها لا تنمو بكفاءة. ومع ذلك ، بعد إضافة A 83-01 ، مثبط إشارات TGF-beta ، وSB202190 ، P-38 خريطة كيناز إشارة المانع ، لوحظ نمو قوي. ومن المثير للاهتمام، وإزالة هذه المثبطات من وسائل الإعلام بعد ستة أيام يؤدي إلى ارتفاع التعبير عن علامة الخلية مستقبلات الذوق العام، Kcnq1، مما يشير إلى أن A 83-01 و SB-202190 تعوق التمايز خلية الذوق.
وهكذا، يتم الحصول على النمو الأمثل والتمايز عن طريق زرع organoids في وسائل الإعلام WENRAS من اليوم صفر إلى ستة وسائل الإعلام و WENR من اليوم السادس إلى 12. تحتوي الأجهزة العضوية الناضجة على خلايا طعم تتميز بالكيراتين-8 والخلايا الظهارية غير المذاق التي تتميز بالكيراتين-13. علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن الكيراتين-13 بمستويات أعلى من جميع علامات خلايا مستقبلات الذوق الثلاثة ، مما يشير إلى أن الأجهزة العضوية تتكون في الغالب من خلايا ظهارية غير مذوق.
الأجهزة العضوية تعبر عن جميع أنواع الخلايا مستقبلات الذوق. يتم التعبير عن الخلايا من النوع الأول التي تتميز Entpd2 والنوع المر بخلايا اثنين تميزت Gnat3 بشكل كبير في الأجهزة العضوية الذوق ، في حين أن نوع الاستشعار الحامض ثلاث خلايا تميزت Car4 أقل شيوعا. يتم توزيع خلايا مستقبلات الذوق عشوائيا في organoids بدلا من هياكل برعم الذوق منفصلة لوحظ في الجسم الحي.
تأكد من تضمين بعض الأنسجة الخلفية إلى CVP عند تشريح اللسان من تجويف الفم. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من كلا الخنادق البوب ويتم الحصول عليها عند تقشير الظهارة.
