Gli organoidi sono una potente tecnologia in vitro utilizzata per lo screening dei farmaci e la comprensione dei processi biologici. Quindi, generare organoidi che modellano la lingua è fondamentale per studiare lo sviluppo e la rigenerazione delle cellule del gusto. I tradizionali studi sul gusto in vivo possono essere costosi e richiedere molto tempo.
Questo protocollo organoide offre un'alternativa standardizzata e riproducibile che riduce al minimo tali sfide consentendo al contempo esperimenti di throughput più elevato. Dopo l'eutanasia di un topo adulto, utilizzare grandi forbici di dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Quindi, sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale.
Tagliare la lingua e raccoglierla in dPBS sterile ghiacciato con calcio e magnesio. Sotto un microscopio sezionante, rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena anteriore dell'eminenza inter malar con una lama di rasoio. Quindi utilizzando una delicata pulizia per rimuovere eventuali peli e liquidi in eccesso dalla lingua posteriore.
Quindi, riempire una siringa da un millilitro con 200-300 microlitri di soluzione enzimatica per iniezione e inserire un ago da mezzo pollice da 30 gauge appena sopra l'eminenza inter malar fino a poco prima delle papille circumvallate o CVP. Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti. Prelevare la siringa lentamente e continuamente dalla lingua mentre la soluzione viene iniettata.
Incubare la lingua e il calcio sterile privo di magnesio dPBS a temperatura ambiente per esattamente 33 minuti. Usando forbici di dissezione extra-fini, fare piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP. Quindi sbucciare delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine.
Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in un tubo microcentrifuga da due millilitro, pre-rivestito con FBS. Aggiungere il cocktail dell'enzima di dissociazione ai tubi contenenti gli epiteli CVP sbucciati e incubarli a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 45 minuti con brevi vortici ogni 15 minuti. Durante gli ultimi 15 minuti di incubazione, pre-guerra 0,25% Tripsina-EDTA a bagnomaria.
Dopo l'incubazione, vorticizzare i tubi in triturato con una pipetta pasteur di vetro per un minuto. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante contenente la prima raccolta di cellule dissociate in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro rivestiti fbS. Ruotare il surnatante per cinque minuti a 370 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le cellule.
Rimuovere il surnatante risultante, quindi risusediare il pellet cellulare nel tampone FACS e tenerlo sul ghiaccio. Per dissociare i restanti pezzi di tessuto nei tubi microcentrifuga originali da due millilitro, aggiungere lo 0,25% di tripsina-EDTA preriscaldato e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con un breve vortice ogni 10 minuti. Quindi, triturare i pezzi di tessuto con una pipetta Pasteur di vetro per un minuto.
Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante nei tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro contenenti le cellule dissociate precedentemente raccolte nel tampone FACS. Ruotare i tubi con le cellule dissociate. Dopo aver rimosso il surnatante, risusedere i pellet cellulari nel tampone FACS e tenerli sul ghiaccio.
Quindi, isolare le cellule positive Lgr5-GFP tramite FACS utilizzando il canale proteico fluorescente verde come descritto nel manoscritto di testo. Trasferire il numero desiderato di cellule sospese Lgr5 positive in un nuovo tubo microcentrifuga. Ruotare il tubo per cinque minuti a 370 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le celle.
Rimuovere il surnatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Risuscisciare delicatamente il pellet cellulare nella quantità appropriata di gel della matrice con un delicato pipettaggio. Quindi mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio in un tubo conico da 50 millilitro per evitare che il gel della matrice si gelifichi.
Aggiungere 15 microlitri del gel della matrice nella miscela cellulare al centro di ciascun pozzettino di una piastra a 48 pozzetti. Per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, mescolare il gel della matrice e la miscela cellulare tubando su e giù dopo la placcatura ogni tre pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 10 minuti per consentire la gelificazione del gel della matrice.
Quindi, aggiungere 300 microlitri di media WENRAS a temperatura ambiente integrati con l'inibitore della roccia, Y27632, a ciascun pozzo e restituire la piastra all'incubatore. Due giorni dopo la placcatura, rimuovere il materiale da ciascun pozzo utilizzando una pipetta da un millilitro o tramite aspirazione sotto vuoto, assicurando che non ci sia contaminazione incrociata tra le condizioni. Aggiungere 300 microlitri di media WENRAS lungo il lato del pozzo, facendo attenzione a non interrompere il gel della matrice e restituire la piastra all'incubatore.
Quando gli organoidi linguali vengono coltivati utilizzando mezzi WENR, non crescono in modo efficiente. Tuttavia, dopo aver aggiunto A 83-01, un inibitore della segnalazione TGF-beta, e SB202190, inibitore della segnalazione della chinasi della mappa P-38, si osserva una crescita robusta. È interessante notare che la rimozione di questi inibitori dai media dopo sei giorni si traduce in una maggiore espressione del marcatore cellulare del recettore del gusto generale, Kcnq1, suggerendo che A 83-01 e SB-202190 ostacolano la differenziazione delle cellule del gusto.
Pertanto, la crescita e la differenziazione ottimali si ottengono coltivando organoidi nei media WENRAS dal giorno zero al sesto e nei media WENR dal sesto al 12° giorno. Gli organoidi maturi contengono sia cellule gustative marcate da cheratina-8 che cellule epiteliali non gustative marcate da cheratina-13. Inoltre, la cheratina-13 è espressa a livelli più elevati rispetto a tutti e tre i marcatori cellulari del recettore del gusto, suggerendo che gli organoidi sono prevalentemente composti da cellule epiteliali non gustative.
Gli organoidi esprimono tutti i tipi di cellule del recettore del gusto. Le cellule di tipo uno contrassegnate da Entpd2 e le cellule di tipo amaro due contrassegnate da Gnat3 sono altamente espresse in organoidi di gusto, mentre le cellule di tipo acido tre contrassegnate da Car4 sono meno comuni. Le cellule del recettore del gusto sono distribuite in modo casuale negli organoidi piuttosto che in discrete strutture di papille gustative osservate in vivo.
Assicurati di includere un po 'di tessuto posteriore al CVP quando seziona la lingua dalla cavità orale. Inoltre, assicurarsi che entrambe le trincee sbuccino e si ottengono quando si sbuccia l'epitelio.
