Organoids הם טכנולוגיית במבחנה רבת עוצמה המשמשת לבדיקת תרופות והבנת תהליכים ביולוגיים. לכן, יצירת אורגנוידים שמדגמים את הלשון חיונית לחקר התפתחות תאי הטעם והתחדשות. מחקרי טעם מסורתיים ב-vivo יכולים להיות יקרים וגוזלי זמן רב.
פרוטוקול organoid זה מציע חלופה סטנדרטית, לשחזור הממזערת אתגרים אלה תוך מתן אפשרות לניסויי תפוקה גבוהים יותר. לאחר המתת חסד עכבר מבוגר, להשתמש מספריים גדולים סטריליים לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. לאחר מכן, להרים את הלשון לחתוך את frenulum לשוני להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה.
חותכים את הלשון ולאסוף אותו ב- dPBS קר כקרח סטרילי עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ מנתח, להסיר ולהשליך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק קה-ביניים של הוד מוהר הבין-מאלי עם סכין גילוח. לאחר מכן באמצעות מנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מן הלשון האחורית.
לאחר מכן, מלא מזרק מיליליטר אחד עם 200 עד 300 microliters של פתרון אנזימי הזרקה ולהכניס מחט 30 מד חצי אינץ 'רק מעל המעמד הבין מלרי עד רק קהור של papillae circumlate, או CVP. הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות. למשוך את המזרק לאט וברצף מן הלשון כמו הפתרון מוזרק.
לדגור על הלשון ואת ה- dPBS נטול מגנזיום סטרילי בטמפרטורת החדר למשך 33 דקות בדיוק. באמצעות מספריים חתך דק במיוחד, לעשות חתכים קטנים אפיתל דו-צדדית רק קהורי של CVP. ואז בעדינות לקלף את האפיתל על ידי הרמתו עם מלקחיים עדינים.
ברגע שאפיתל התעלה הוא ללא רקמת החיבור הבסיסית, למקם אותו לתוך שני מיליליטר צינור microcentrifuge, מצופה מראש עם FBS. מוסיפים את קוקטייל אנזימי הדיסוציאציה לצינורות המכילים את אפיתליה CVP קלופה ודגר אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם מערבולת קצרה כל 15 דקות. במהלך 15 הדקות האחרונות של הדגירה, לפני המלחמה 0.25%טריפסין-EDTA באמבט המים.
לאחר הדגירה, מערבולת הצינורות טריטוראט עם פיפטה פסטר זכוכית במשך דקה אחת. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה הסופר-טבעית המכילה את האוסף הראשון של תאים מנותקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים מצופים FBS של 1.5 מיליליטר. סובבו את הסופר-נט במשך חמש דקות ב-370 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס כדי לגלגל את התאים.
הסר את supernatant וכתוצאה מכך, ולאחר מכן resuspend גלולה התא במאגר FACS ולשמור אותו על קרח. כדי לנתק את חתיכות הרקמה הנותרות בצינורות המיקרו-צנטריפוגה המקוריים של שני מיליליטר, הוסיפו 0.25% טריפסין-EDTA 10 דקות ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולת קצרה כל 10 דקות. לאחר מכן, טריטוריאט את חתיכות הרקמה עם פיפטת פסטר מזכוכית למשך דקה אחת.
לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, pipette את supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל את התאים מנותקים שנאספו בעבר במאגר FACS. סובב את הצינורות עם התאים המנותנים. לאחר הסרת supernatant, resuspend כדורי התא במאגר FACS ולשמור אותם על קרח.
לאחר מכן, לבודד את התאים החיוביים Lgr5-GFP באמצעות FACS באמצעות ערוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק כמתואר בכתב היד טקסט. העבר את המספר הרצוי של Lgr5 חיובי מושעה לתוך צינור microcentrifuge חדש. לסובב את הצינור במשך חמש דקות ב 370 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי כדורי התאים.
הסר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח. יש להצמיד בעדינות את גלולה התא בכמות המתאימה של ג'ל מטריצה עם צנרת עדינה. ואז לשמור את צינור microcentrifuge על קרח בצינור חרוט 50 מיליליטר כדי למנוע את ג'ל מטריצה מג'ל.
מוסיפים 15 מיקרוליטרים של ג'ל המטריצה בתערובת התאים במרכז כל באר של צלחת 48-well. כדי להבטיח חלוקה אחידה של תאים, מערבבים את ג'ל המטריצה ותערובת התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה לאחר ציפוי כל שלוש בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות במשך 10 דקות כדי לאפשר gelling של ג'ל מטריצה.
לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של טמפרטורת החדר WENRAS מדיה בתוספת מעכב הסלע, Y27632, לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור. יומיים לאחר ה ציפוי, להסיר את המדיה מכל באר באמצעות pipette אחד מיליליטר או באמצעות שאיפה ואקום, להבטיח לא זיהום צולב בין התנאים. הוסף 300 מיקרוליטרים של מדיה WENRAS בצד של הבאר, דואג לא לשבש את ג'ל מטריצה ולהחזיר את הצלחת לחממה.
כאשר אורגנוידים לשוניים מתורבתים באמצעות מדיה WENR, הם אינם גדלים ביעילות. עם זאת, לאחר הוספת A 83-01, מעכב איתות TGF-בטא, ו SB202190, מעכב איתות מפת P-38, צמיחה חזקה נצפתה. מעניין, הסרת מעכבים אלה מהתקשורת לאחר שישה ימים גורמת לביטוי גבוה יותר של סמן תא קולטן טעם כללי, Kcnq1, מה שמרמז כי A 83-01 ו- SB-202190 לעכב את בידול תאי הטעם.
לכן, צמיחה אופטימלית ובידול מתקבלים על ידי organoids culturing במדיה WENRAS מהיום אפס עד שש ומדיה WENR מהיום השישי עד 12. אורגנוידים בוגרים מכילים הן תאי טעם המסומנים על ידי קרטין-8 ותאי אפיתל שאינם בעלי טעם המסומנים על ידי קרטין-13. יתר על כן, קרטין-13 מתבטא ברמות גבוהות יותר מכל שלושת סמני תא קולטן הטעם, דבר המצביע על כך שאורגנואידים מורכבים בעיקר מתאי אפיתל שאינם בעלי טעם.
האורגנוידים מבטאים את כל סוגי תאי קולטן הטעם. סוג אחד תאים המסומנים על ידי Entpd2 וסוג מר שני תאים המסומנים על ידי Gnat3 באים לידי ביטוי מאוד באורגנוידים של טעם, בעוד חישה חמוצה סוג שלושה תאים המסומנים על ידי Car4 הם פחות נפוצים. תאי קולטן הטעם מופצים באופן אקראי באורגנוידים ולא במבני בלוטות טעם נפרדים שנצפו ב- vivo.
הקפד לכלול כמה רקמה אחורית ל- CVP בעת ניתוח הלשון מחלל הפה. בנוסף, ודא את שתי החפירות לקפוץ החוצה מתקבלים בעת קילוף האפיתל.
