Organoides são poderosas tecnologias in vitro usadas para triagem de drogas e compreensão de processos biológicos. Assim, gerar organoides que modelam a língua é crucial para estudar o desenvolvimento e a regeneração das células de paladar. Estudos tradicionais de sabor in vivo podem ser caros e demorados.
Este protocolo organoide oferece uma alternativa padronizada e reprodutível que minimiza esses desafios, permitindo experiências de maior throughput. Depois de eutanásia um rato adulto, use uma grande tesoura de dissecção estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Em seguida, levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do chão da cavidade oral.
Corte a língua para fora e colete-a em dPBS gelado estérei com cálcio e magnésio. Sob um microscópio dissecando, remova e descarte a língua anterior cortando apenas antes da eminência inter malar com uma lâmina de barbear. Em seguida, usando uma tarefa delicada limpar para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da língua posterior.
Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com 200 a 300 microlitros de solução de enzima de injeção e insira uma agulha de meia polegada de calibre 30 logo acima da eminência inter malar até apenas antes da papila circunvallada, ou CVP. Injete a solução enzimápica por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes. Retire a seringa lentamente e continuamente da língua enquanto a solução está sendo injetada.
Incubar a língua e dPBS livres de magnésio de cálcio estéril à temperatura ambiente por precisamente 33 minutos. Utilizando uma tesoura de dissecção extra-fina, faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e apenas anterior do CVP. Em seguida, descasque suavemente o epitélio levantando-o com fórceps finos.
Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em dois tubos de microcentrífugo mililitro, pré-revestidos com FBS. Adicione o coquetel de dissociação enzimática aos tubos contendo a epitélia CVP descascada e incuba-os em um banho de água de 37 graus Celsius por 45 minutos com breve vórtice a cada 15 minutos. Durante os últimos 15 minutos de incubação, pré-aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA no banho de água.
Após a incubação, vórtice os tubos em triturate com uma pipeta Pasteur de vidro por um minuto. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer contendo a primeira coleção de células dissociadas em novos tubos de microcentrífuga revestidos de 1,5 mililitro. Gire o supernante por cinco minutos a 370 vezes G e quatro graus Celsius para pelotar as células.
Remova o supernatante resultante, em seguida, resuspense a pelota celular no buffer FACS e mantenha-a no gelo. Para dissociar as peças de tecido restantes nos dois tubos originais de microcentrífugo mililitro, adicione 0,25% de trypsin-EDTA pré-aquecido e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos com breve vórtice a cada 10 minutos. Em seguida, triturar os pedaços de tecido com uma pipeta pasteur de vidro por um minuto.
Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer nos tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo as células dissociadas previamente coletadas no buffer FACS. Gire os tubos com as células dissociadas. Depois de remover o supernatante, resuspense as pelotas de célula no buffer FACS e mantenha-as no gelo.
Em seguida, isole as células positivas Lgr5-GFP via FACS usando o canal de proteína fluorescente verde, conforme descrito no manuscrito do texto. Transfira o número desejado de células suspensas lgr5 positivas para um novo tubo de microcentrifusagem. Gire o tubo por cinco minutos a 370 vezes G e quatro graus Celsius para pelotar as células.
Remova o supernatante e coloque o tubo no gelo. Levemente resuspenque a pelota celular na quantidade apropriada de gel de matriz com tubulação suave. Em seguida, mantenha o tubo de microcentrifuge no gelo em um tubo cônico de 50 mililitros para evitar que o gel de matriz geleia.
Adicione 15 microliters do gel de matriz na mistura celular no centro de cada poço de uma placa de 48 poços. Para garantir uma distribuição uniforme das células, misture o gel de matriz e a mistura celular por pipetar para cima e para baixo depois de emplaar a cada três poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 10 minutos para permitir a gelagem do geleio matricial.
Em seguida, adicione 300 microliters de temperatura ambiente wenras mídia complementada com o inibidor de rocha, Y27632, a cada poço e devolva a placa para a incubadora. Dois dias após o revestimento, remova a mídia de cada poço usando uma pipeta de um mililitro ou através de aspiração de vácuo, garantindo nenhuma contaminação cruzada entre as condições. Adicione 300 microliters de mídia WENRAS ao lado do poço, tomando cuidado para não interromper o gel de matriz e devolver a placa à incubadora.
Quando organoides linguais são cultivados usando mídia WENR, eles não crescem eficientemente. No entanto, depois de adicionar um 83-01, um inibidor de sinalização TGF-beta, e SB202190, p-38 mapeando o inibidor de sinalização de quinase, o crescimento robusto é observado. Curiosamente, remover esses inibidores da mídia após seis dias resulta em maior expressão do marcador de células receptores de sabor geral, Kcnq1, sugerindo que A 83-01 e SB-202190 dificultam a diferenciação das células de paladar.
Assim, o ótimo crescimento e diferenciação são obtidos por organoides de cultura na mídia WENRAS do dia zero ao seis e mídia WENR do sexto ao 12º dia. Organoides maduros contêm ambas as células de sabor marcadas por queratina-8 e células epiteliais sem gosto marcadas por queratina-13. Além disso, a queratina-13 é expressa em níveis mais altos do que todos os três marcadores celulares receptores de sabor, sugerindo que os organoides são predominantemente compostos de células epiteliais sem gosto.
Os organoides expressam todos os tipos de células receptoras de sabor. Células tipo um marcadas por Entpd2 e células amargas do tipo dois marcadas por Gnat3 são altamente expressas em organoides de sabor, enquanto as células de sensoriamento azedo tipo três marcadas pelo Car4 são menos comuns. As células receptoras de paladar são distribuídas aleatoriamente nos organoides e não em estruturas discretas de paladar observadas in vivo.
Certifique-se de incluir algum tecido posterior ao CVP ao dissecar a língua da cavidade oral. Além disso, certifique-se de que ambas as trincheiras saem e são obtidas ao descascar o epitélio.
