器官是用于药物筛选和理解生物过程的强大的体外技术。因此，生成模拟舌头的器官对于研究味觉细胞发育和再生至关重要。传统的体内味觉研究可能既昂贵又费时。
此器官协议提供了一个标准化的、可重复的替代方案，可最大限度地减少这些挑战，同时允许更高的吞吐量实验。对成年老鼠实施安乐死后，使用大无菌解剖剪刀割断脸颊并打断下颚。然后，抬起舌头，切开语言，将舌头从口腔的地板上分离。
切掉舌头，用钙和镁在无菌的冰冷 dPBS 中收集。在解剖显微镜下，只需用剃须刀刀片切割前部的异常显赫，就取出并丢弃前舌。然后使用精细的任务擦拭，以去除任何头发和多余的液体从后舌。
接下来，用 200 至 300 微升注射酶溶液填充一毫升注射器，并在麦芽管显赫上方插入一根 30 米半的针头，直到环状的前部或 CVP 。将酶溶液注射到上皮和底层组织之间的 CVP 的横向边缘。当溶液被注射时，缓慢而连续地从舌头中取出注射器。
在室温下孵育舌头和无菌无镁钙 dPBS 精确 33 分钟。使用超细解剖剪刀，在上皮上进行双边小切口，并仅对 CVP 前部进行切割。然后用细钳将其抬起来轻轻剥去上皮。
一旦沟渠上皮没有底层结缔组织，将其放入两毫升微中心管中，预先涂上FBS。将分离酶鸡尾酒加入含有去皮CVP的管子中，在37摄氏度的水浴中孵育45分钟，每15分钟短暂旋转一次。在最后15分钟的孵化中，预热0.25%的特里普辛-EDTA在水浴中。
孵化后，用玻璃巴斯德移液器将管子旋转一分钟。组织片落定后，将含有第一批分离细胞的超高分子移液器放入新的FBS涂层的1.5毫升微中心管中。在370倍G和4摄氏度的高温下旋转超高分子5分钟，使细胞颗粒化。
取出产生的超高纳特，然后将细胞颗粒重新悬浮在FACS缓冲器中，并将其保留在冰上。要分离原始两毫升微中心管中剩余的组织片段，请添加预热 0.25% 的 Trypsin-EDTA，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，每 10 分钟短暂涡流一次。然后，用玻璃巴斯德移液器将纸巾碎片搅乱一分钟。
组织片落定后，将超纳特移入含有以前收集的FACS缓冲器中分离细胞的1.5毫升微中心管中。旋转管与分离的细胞。取出超高分子后，将细胞颗粒重新存放在FACS缓冲器中，并将其留在冰上。
然后，使用文本手稿中描述的绿色荧光蛋白通道，通过 FACS 分离 Lgr5-GFP 阳性细胞。将Lgr5阳性悬浮细胞的预期数量转移到新的微中心管中。在370倍G和4摄氏度下旋转管子5分钟，使细胞颗粒化。
取出超高线，将管子放在冰上。用温和的管道轻轻将细胞颗粒重新用适量的基质凝胶重新喷出。然后将微中心管放在冰上，放在50毫升圆锥管中，以防止基质凝胶凝胶凝胶凝胶。
在 48 井板的每个井的中心加入 15 微升基质凝胶的细胞混合物。为了确保细胞的均匀分布，在每三口井电镀后上下管道混合基质凝胶和细胞混合物。将板放在37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的孵化器中10分钟，以允许基质凝胶凝胶。
然后，在每个井中加入300微升室温WENRAS介质，辅以岩石抑制剂Y27632，并将板返回孵化器。电镀两天后，使用一毫升移液器或真空吸气器从每口井中取出介质，确保条件之间不会交叉污染。在井边添加 300 微升 WENRAS 介质，注意不要破坏基质凝胶，并将板返回到孵化器中。
当语言器官使用WENR介质培养时，它们不会有效生长。然而，在添加了 TGF-beta 信号抑制剂 A 83-01 和 SB202190 之后，P-38 地图激酶信号抑制剂，观察到强劲增长。有趣的是，在六天后从介质中去除这些抑制剂会导致一般味觉受体细胞标记 Kcnq1 表达率更高，这表明 A 83-01 和 SB-202190 阻碍味觉细胞分化。
因此，从第 0 天到第 6 天，WENRAS 媒体中的培养器官，从第 6 天到第 12 天，WENR 媒体的培养器官，可以获得最佳的生长和分化。成熟的器官都含有以角蛋白-8为标志的味觉细胞和以角蛋白-13标记的非味上皮细胞。此外，角蛋白-13的表达水平高于所有三种味觉受体细胞标记，表明器官主要由非味上皮细胞组成。
器官表达所有味觉受体细胞类型。以 Entpd2 标记的一型细胞和以 Gnat3 标记的苦涩型 2 细胞在味觉器官中表达得非常强烈，而以 Car4 标记的酸感应型三细胞则不太常见。味觉受体细胞随机分布在器官中，而不是在体内观察到的离散味蕾结构中。
在从口腔中解剖舌头时，请务必将一些组织后遗入 CVP。此外，确保两个战壕弹出，并在剥皮时获得。
