Les organoïdes sont une technologie in vitro puissante utilisée pour le dépistage des médicaments et la compréhension des processus biologiques. Ainsi, la génération d’organoïdes qui modélisent la langue est cruciale pour étudier le développement et la régénération des cellules gustatives. Les études gustatives in vivo traditionnelles peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps.
Ce protocole organoïde offre une alternative standardisée et reproductible qui minimise ces défis tout en permettant des expériences à plus haut débit. Après avoir euthanasié une souris adulte, utilisez de gros ciseaux à dissection stériles pour couper les joues et casser la mâchoire. Ensuite, soulevez la langue et coupez le frein linguale pour séparer la langue du sol de la cavité buccale.
Coupez la langue et recueillez-la dans du dPBS stérile glacé avec du calcium et du magnésium. Sous un microscope à dissection, retirez et jetez la langue antérieure en coupant juste avant l’éminence inter malaire avec une lame de rasoir. Ensuite, en utilisant une tâche délicate essuyez pour enlever les poils et l’excès de liquide de la langue postérieure.
Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec 200 à 300 microlitres de solution enzymatique injectable et insérez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 juste au-dessus de l’éminence intermalaire jusqu’à juste avant les papilles circumvallates, ou CVP. Injecter la solution enzymatique sous et sur les bords latéraux du CVP entre l’épithélium et les tissus sous-jacents. Retirez la seringue lentement et continuellement de la langue pendant l’injection de la solution.
Incuber la langue et le dPBS stérile sans calcium et magnésium à température ambiante pendant 33 minutes précises. À l’aide de ciseaux à dissection extra-fins, faites de petites coupures dans l’épithélium bilatéralement et juste avant le CVP. Ensuite, pelez doucement l’épithélium en le soulevant avec une pince fine.
Une fois que l’épithélium de la tranchée est libre du tissu conjonctif sous-jacent, placez-le dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres, pré-enduit de FBS. Ajouter le cocktail d’enzymes de dissociation aux tubes contenant l’épithélium CVP pelé et les incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes avec un bref vortex toutes les 15 minutes. Au cours des 15 dernières minutes d’incubation, pré-pré-température 0,25% trypsine-EDTA au bain-marie.
Après l’incubation, vortex les tubes en trituration avec une pipette Pasteur en verre pendant une minute. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipettez le surnageant contenant la première collection de cellules dissociées dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre revêtus de FBS. Faites tourner le surnageant pendant cinq minutes à 370 fois G et quatre degrés Celsius pour granuler les cellules.
Retirez le surnageant résultant, puis ressuspendez la pastille de cellule dans un tampon FACS et conservez-la sur la glace. Pour dissocier les morceaux de tissu restants dans les tubes de microcentrifugation d’origine de deux millilitres, ajoutez de la trypsine-EDTA préchauffée à 0,25% et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un bref vortex toutes les 10 minutes. Ensuite, triturez les morceaux de tissu avec une pipette Pasteur en verre pendant une minute.
Une fois les morceaux de tissus réglés, pipettez le surnageant dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant les cellules dissociées précédemment collectées dans un tampon FACS. Faites tourner les tubes avec les cellules dissociées. Après avoir retiré le surnageant, ressuspendez les pastilles cellulaires dans un tampon FACS et conservez-les sur la glace.
Ensuite, isolez les cellules Lgr5-GFP positives via FACS en utilisant le canal de protéine fluorescente verte comme décrit dans le manuscrit du texte. Transférer le nombre souhaité de cellules en suspension Lgr5 positives dans un nouveau tube de microcentrifugation. Faites tourner le tube pendant cinq minutes à 370 fois G et quatre degrés Celsius pour granuler les cellules.
Retirez le surnageant et placez le tube sur de la glace. Remettez doucement en charge la pastille de cellule dans la quantité appropriée de gel matriciel avec un pipetage doux. Ensuite, gardez le tube de microcentrifugation sur de la glace dans un tube conique de 50 millilitres pour empêcher le gel matriciel de geler.
Ajouter 15 microlitres du gel matriciel dans un mélange cellulaire au centre de chaque puits d’une plaque de 48 puits. Pour assurer une distribution uniforme des cellules, mélangez le gel matriciel et le mélange cellulaire en pipetant de haut en bas après le placage tous les trois puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité pendant 10 minutes pour permettre la gélification du gel matriciel.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de milieu WENRAS à température ambiante complétés par l’inhibiteur de roche, Y27632, à chaque puits et retournez la plaque à l’incubateur. Deux jours après le placage, retirez le média de chaque puits à l’aide d’une pipette d’un millilitre ou par aspiration sous vide, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de contamination croisée entre les conditions. Ajouter 300 microlitres de support WENRAS sur le côté du puits, en prenant soin de ne pas perturber le gel matriciel et de renvoyer la plaque à l’incubateur.
Lorsque les organoïdes linguaux sont cultivés à l’aide de milieux WENR, ils ne se développent pas efficacement. Cependant, après avoir ajouté A 83-01, un inhibiteur de signalisation TGF-bêta, et SB202190, inhibiteur de signalisation de la carte kinase P-38, une croissance robuste est observée. Fait intéressant, l’élimination de ces inhibiteurs du milieu après six jours entraîne une expression plus élevée du marqueur général des cellules réceptrices du goût, Kcnq1, ce qui suggère que A 83-01 et SB-202190 entravent la différenciation des cellules gustatives.
Ainsi, une croissance et une différenciation optimales sont obtenues en cultivant des organoïdes dans des milieux WENRAS du jour zéro au sixième jour et des milieux WENR du sixième au 12e jour. Les organoïdes matures contiennent à la fois des cellules gustatives marquées par la kératine-8 et des cellules épithéliales non gustatives marquées par la kératine-13. En outre, la kératine-13 est exprimée à des niveaux plus élevés que les trois marqueurs des cellules réceptrices du goût, ce qui suggère que les organoïdes sont principalement composés de cellules épithéliales sans goût.
Les organoïdes expriment tous les types de cellules réceptrices du goût. Les cellules de type un marquées par Entpd2 et les cellules amères de type deux marquées par Gnat3 sont fortement exprimées en organoïdes gustatifs, tandis que les cellules de type trois à détection aigre marquées par Car4 sont moins courantes. Les cellules réceptrices du goût sont réparties aléatoirement dans les organoïdes plutôt que dans des structures discrètes des papilles gustatives observées in vivo.
Assurez-vous d’inclure un peu de tissu postérieur au CVP lorsque vous disséquez la langue de la cavité buccale. De plus, assurez-vous que les deux tranchées sortent et sont obtenues lors du pelage de l’épithélium.
