Organoidler, ilaç taraması ve biyolojik süreçleri anlamak için kullanılan güçlü in vitro teknolojidir. Bu nedenle, dili modelleyen organoidler üretmek, tat hücresi gelişimini ve yenilenmesini incelemek için çok önemlidir. Geleneksel in vivo tat çalışmaları pahalı ve zaman alıcı olabilir.
Bu organoid protokolü, daha yüksek aktarım hızı denemelerine izin verirken bu zorlukları en aza indiren standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir alternatif sunar. Yetişkin bir fareyi ötenazi ettikten sonra, yanakları kesmek ve çeneyi kırmak için büyük steril diseksiyon makası kullanın. Daha sonra dili kaldırın ve dili ağız boşluğunun zemininden ayırmak için dil frenulumunun kesilmesini kesin.
Dili kesin ve kalsiyum ve magnezyum ile steril buz gibi dPBS'de toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, bir jiletle ara malar kardinalinin sadece ön kısmını keserek ön dili çıkarın ve atın. Daha sonra arka dilden herhangi bir saç ve fazla sıvı çıkarmak için hassas bir görev mendili kullanarak.
Daha sonra, bir mililitre şırıngayı 200 ila 300 mikrolitre enjeksiyon enzim çözeltisi ile doldurun ve sirkülat papillanın veya CVP'nin sadece ön kısmına kadar ara malar kardinalansın hemen üzerine 30 kalibre yarım inçlik bir iğne yerleştirin. Enzim çözeltisini CVP'nin altına ve yan kenarlarına epitel ve alttaki dokular arasına enjekte edin. Çözelti enjekte edilirken şırınnayı dilden yavaşça ve sürekli olarak çekin.
Dili kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığında steril kalsiyum magnezyum içermeyen dPBS'yi tam olarak 33 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Ekstra ince diseksiyon makası kullanarak, epitelde iki taraflı ve CVP'nin sadece ön kısmında küçük kesikler yapın. Daha sonra epitelleri ince epiplerle kaldırarak hafifçe soyun.
Hendek epitel alttaki bağ dokusundan arındırıldıktan sonra, FBS ile önceden kaplanmış iki mililitre mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Soyulmuş CVP epitelini içeren tüplere ayrışma enzim kokteylini ekleyin ve her 15 dakikada bir kısa vorteksleme ile 45 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosunda kuluçkaya yatırın. Kuluçkanın son 15 dakikasında, su banyosunda% 0.25 Trypsin-EDTA ön ısıtma.
Kuluçkadan sonra, tüpleri bir dakika boyunca bir cam Pasteur pipetle tritüre edin. Doku parçaları yerleştikten sonra, ayrışmış hücrelerin ilk koleksiyonunu içeren süpernatantı yeni FBS kaplamalı 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Hücreleri peletmek için süpernatant'ı 370 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün.
Elde edilen süpernatant çıkarın, sonra hücre peletini FACS arabelleğine yeniden saklayın ve buzda tutun. Orijinal iki mililitre mikrosantrifüj tüpünde kalan doku parçalarını ayrıştırmak için önceden ısıtılmış %0,25 Trypsin-EDTA ekleyin ve her 10 dakikada bir kısa girdap ile 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, doku parçalarını bir dakika boyunca bir cam Pasteur pipetle üçe bölün.
Doku parçaları yerleştikten sonra, süpernatantı FACS tamponunda daha önce toplanan ayrışmış hücreleri içeren 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Tüpleri ayrışmış hücrelerle döndürün. Üstnatant çıkarıldıktan sonra, hücre peletlerini FACS tamponunda yeniden çıkarın ve buzda tutun.
Daha sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi yeşil floresan protein kanalını kullanarak LGR5-GFP pozitif hücrelerini FACS aracılığıyla izole edin. İstediğiniz sayıda Lgr5 pozitif askıya alınmış hücreyi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri peletmek için tüpü 370 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün.
Üst saltantayı çıkarın ve tüpü buza yerleştirin. Hücre peletini yumuşak pipetleme ile uygun miktarda matris jelinde hafifçe yeniden dürt. Daha sonra matris jelinin jelleşmesini önlemek için mikrosantrifüj tüpünü 50 mililitrelik konik bir tüpte buz üzerinde tutun.
48 kuyulu bir plakanın her kuyusunun ortasına hücre karışımına 15 mikrolitre matris jeli ekleyin. Hücrelerin eşit bir dağılımını sağlamak için, her üç kuyuyu kapladıktan sonra yukarı ve aşağı pipetleme yaparak matris jeli ve hücre karışımını karıştırın. Matris jelinin jellenmesine izin vermek için plakayı 37 santigrat derece, % 5 karbondioksit ve% 95 nemde bir inkübatöre 10 dakika yerleştirin.
Ardından, her kuyuya Y27632 kaya inhibitörü ile desteklenmiş 300 mikrolitre oda sıcaklığı WENRAS ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri verin. Kaplamadan iki gün sonra, bir mililitre pipet kullanarak veya vakum aspirasyonu ile ortamı her kuyudan çıkarın ve koşullar arasında çapraz kontaminasyon olmamasını sağlayın. Matris jelini bozmamaya ve plakayı inkübatöre geri döndürmeye dikkat ederek kuyunun kenarına 300 mikrolitre WENRAS ortamı ekleyin.
Lingual organoidler WENR ortamı kullanılarak kültürlendiğinde, verimli bir şekilde büyümezler. Bununla birlikte, bir TGF-beta sinyal inhibitörü olan A 83-01 ve SB202190, P-38 harita kinaz sinyal inhibitörü ekledikten sonra sağlam büyüme gözlenir. İlginçtir ki, bu inhibitörlerin altı gün sonra medyadan çıkarılması, genel tat reseptör hücre işaretleyicisinin daha yüksek ekspresyonlanmasıyla sonuçlanır, Kcnq1, A 83-01 ve SB-202190'ın tat hücresi farklılaşmasına engel olduğunu düşündürmektedir.
Böylece, WENRAS medyasında organoidlerin sıfırdan altıya ve WENR ortamlarının altıncı günden 12.güne kadar kültlenmesiyle optimal büyüme ve farklılaşma elde edilir. Olgun organoidler hem keratin-8 ile işaretlenmiş tat hücrelerini hem de keratin-13 ile işaretlenmiş tatsız epitel hücrelerini içerir. Ayrıca, keratin-13 her üç tat reseptör hücre belirteçlerinden daha yüksek seviyelerde ifade edilir ve organoidlerin ağırlıklı olarak tatsız epitel hücrelerden oluştuğunu düşündürmektedir.
Organoidler tüm tat reseptör hücre tiplerini ifade eder. Entpd2 ile işaretlenmiş tip 1 hücreler ve Gnat3 ile işaretlenmiş acı tip iki hücreler tat organoidlerinde yüksek oranda ifade edilirken, Car4 ile işaretlenmiş ekşi algılama tipi üç hücre daha az yaygındır. Tat reseptör hücreleri, in vivo olarak gözlenen ayrık tat tomurcuk yapılarında değil, organoidlerde rastgele dağıtılır.
Dili ağız boşluğundan parçalarken CVP'ye bazı doku posteriorları eklediğinizden emin olun. Ayrıca, epitel soyulurken her iki siperin de ortaya çıktığından ve elde edildiğinden emin olun.
