سرطان الخلايا الحرشفية المريئي ، ESCC ، مميت ومنتشر في جميع أنحاء العالم. يمكن استخدام المواد العضوية ثلاثية الأبعاد لتسريع التقدم في هذا المجال لمكافحة العبء الشديد ل ESCC. يمكن التلاعب بعضويات 3D المشتقة من خلية واحدة من الفئران المعالجة ب 4NQO بسهولة وبتكلفة زهيدة للتعليق الوظيفي للتغيرات الجزيئية المصاحبة لبدء ESCC وتطويره.
يلتقط هذا النموذج عدم التجانس الجيني للأورام التي يسببها الطفرات. لذلك ، توفر هذه الكائنات العضوية منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاختبار استراتيجيات علاجية جديدة أو تحديد التغيرات الجينية البارزة التي تقود تكوين الأورام. سيساعد في إظهار تشريح الحيوانات وجمع الأعضاء ياسوتو توميتا ، وهو موظف مشارك ، وسيظهر نوريهيرو ماتسورا ، زميل أبحاث ما بعد الدكتوراه من مختبري ، إعداد العضو العضوي لإجراء تضمين البارافين.
للبدء ، افتح جلد الفئران الرحيمة عن طريق الضغط على الفراء في منتصف البطن واستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق خط الوسط القحفي الذيلي البطني من أسفل البطن إلى الذقن. بدءا من شق خط الوسط ، قم بعمل جروح شعاعية تمتد إلى الأطراف على جانبي الماوس ، وتضخيم اللوحات الجلدية مفتوحة. لفضح القصبة الهوائية العنقية ، باستخدام مقص تشريح ، قسم الغدد اللعابية عند خط الوسط.
لفضح القصبة الهوائية الصدرية ، قم بإزالة القص. قرصة بلطف ورفع الصفاق بالملقط واستخدام مقص لتقسيم الصفاق القحفي الذلي. وبشكل جانبي على طول القفص الصدري.
اسحب الكبد برفق من السطح الذيلي للحجاب الحاجز واستخدم المقص لعمل شق صغير في الحجاب الحاجز عند الشق القصي ، وتحديدا على السطح الظهري لعملية الخنجري. بمجرد فصل القفص الصدري عن محتويات الصدر ، أدخل مقصا في شق الحجاب الحاجز وقم بتشريح الجمجمة إلى حزام عنق الرحم الملتصق بشكل وثيق بالسطح الظهري للقص لتجنب تلف الأعضاء أدناه. قطع الأضلاع على جانبي القص باستخدام مقص وإزالة القص.
لكشف المريء البطني ، ارفع المعدة برفق من الأمام عن طريق إمساك الغار بالملقط. باستخدام المقص ، تشريح الطحال والبنكرياس والمساريق من المعدة والمريء. لكشف المريء الصدري ، ارفع القصبة الهوائية برفق على الفور إلى غضروف الغدة الدرقية ، وقم بتشريح المريء في الجانب الظهري من القصبة الهوائية باستخدام مقص القزحية.
قسم القصبة الهوائية في غضروف الغدة الدرقية بمقص القزحية. قشر القصبة الهوائية من بقية المريء عن طريق تشريحها بعناية في الاتجاه الذيلي. قم بإزالة الرئة والقلب والغدة الصعترية تماما مع القصبة الهوائية.
قسم المعدة عند البواب بالمقص. افصل المريء عن الفقرة عن طريق إمساك الغار بالملقط وتشريح الجمجمة. تقسيم المريء على مستوى غضروف الغدة الدرقية وحصاد المريء والمعدة تماما.
افصل المعدة والمريء عن طريق تقسيم المريء عند القلب وتشريح أي لفافة على السطح الخارجي للمريء. لحجز عينة للأنسجة ، قم بتقسيمها طوليا بالمقص. ضع المريء السليم المتبقي و PBS البارد على الجليد.
افتح المعدة على طول الانحناء الأكبر واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بما فيه الكفاية. افصل المعدة الأمامية واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. لحصاد اللسان ، قم بإزالة الإبرة المثبتة من الأنف واسحب اللسان بالملاقط.
قطع اللسان لأطول فترة ممكنة ووضعه في برنامج تلفزيوني بارد على الجليد. بعد نقل الأنسجة المنفصلة إلى طبق الثقافة ، قم بإزالة طبقة العضلات بعناية من الظهارة باستخدام الملقط. انقل الظهارة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين واحتضانه في خلاط حراري لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة.
بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة ، انقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر محفوظة على أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مع طرف عريض التجويف باستخدام حركات دائرية ، ثم أضف 3 ملليلتر من مثبطات التربسين فول الصويا ، أو الأمراض المنقولة جنسيا ، من خلال المصفاة باستخدام حركات دائرية للغسيل ، ثم افرك المصفاة بقاعدة مكبس حقنة السل سعة 1 ملليلتر لدفع الخلايا من خلالها. اغسل المصفاة ب 3 ملليلتر من PBS من 3 إلى 5 مرات ، مع تنظيف المصفاة بقاعدة المحقنة بين الغسلات. بعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية مع ترك 1 ملليلتر من المحلول في الأنبوب لإعادة التعليق.
بمجرد إعادة الحبيبات ، انقل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر. بعد الطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى ، أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الوسط العضوي للفأر ، أو MOM ، وقم بإجراء تعداد آلي للخلايا. لوحة 5 ، 000 خلية قابلة للحياة في 75 ٪ استخراج الغشاء القاعدي ، أو BME ، و MOM مع حجم إجمالي 50 ميكرولتر لكل بئر.
باستخدام طرف عريض التجويف سعة 200 ميكرولتر ، أضف ببطء قطرة 50 ميكرولتر إلى وسط كل بئر لتجنب التلامس بين الطرف وأسفل أو جوانب البئر. اسمح ل BME بالتصلب لمدة 30 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة نسبية. بعد الحضانة ، أضف بعناية 500 ميكرولتر من MOM لكل بئر.
قم بتغيير MOM في اليوم 3 أو 4 ، ثم كل 2 إلى 3 أيام بعد ذلك حتى تصبح جاهزة للمرور. احتفظ ب BME المذاب على الثلج ، وقم بتسخين MOM مسبقا ، و 0.05٪ من التربسين ، والأمراض المنقولة جنسيا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. باستخدام طرف ماصة صغيرة عريض التجويف ، اجمع المواد العضوية في قبة BME جنبا إلى جنب مع المادة الطافية وقم بتعطيل BME عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
بعد الحصول على الحبيبات العضوية عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة ، بمجرد إزاحتها ، أعد تعليقها في 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين. احتضان الأنبوب في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تعطيل التربسين مع 600 ميكرولتر من الأمراض المنقولة جنسيا.
بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من MOM. قم بإجراء عدد تلقائي للخلايا عن طريق استبعاد trypan blue. لإصلاح المواد العضوية ، قم بإزاحة الحبيبات برفق وإعادة تعليقها في 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بإعداد سطح التضمين عن طريق قلب رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتغطية السطح بورقة من فيلم السقف ، ثم قم بتسمية المعرف العضوي المقابل. تراكب بعناية paraformaldehyde إزالتها في بيليه عضوي مغسول ب PBS عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من أجار أسفل جانب الأنبوب. كرر هذه الخطوة.
دون إزعاج الحبيبات ، انقل الحبيبات الموجودة في قطرة هلام أجار إلى فيلم السقف على سطح التضمين للتصلب عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. باستخدام ملقط ، انقل بعناية القطرة التي تحتوي على الحبيبات العضوية الصلبة إلى شريط علم الأمراض المسمى. تم تحليل لسان المريء الطبيعي للفأر وعضويات المعدة الأمامية شكليا عن طريق التصوير الساطع والتلوين النسيجي.
أظهر سرطان الخلايا الحرشفية المريئي من فأر معالج ب 4NQO عدم نمطية نووية وتقرن مفاجئ. أظهرت قدرة التجديد الذاتي للعضويات التي تم تقييمها من خلال تحديد معدل تكوين الأعضاء على الثقافة الفرعية أن معدل التكوين يتناقص كدالة للوقت مما يعكس انخفاض الخلايا القاعدية التكاثرية في الكائنات العضوية الناضجة. يتم الكشف عن حركية نمو المواد العضوية من خلال مورفولوجيتها في نقاط زمنية مختلفة.
يصبح التقرن في النواة الداخلية للعضويات بارزا بحلول اليوم 10. تبقى الخلايا القاعدية التكاثرية في طبقة الخلايا الخارجية ، حتى في اليوم 14 واليوم 21 نقطة زمنية. يوضح منحنى مضاعفة عدد السكان من عضويات لسان الفأر الطبيعية الناتجة عن الفئران غير المعالجة 4NQO نموها المطرد عبر ممرات متعددة وثقافة طويلة الأجل.
المواد العضوية هي منصات للفحص عالي الإنتاجية لتحديد أهداف علاجية جديدة ، والتحرير القائم على كريسبر لاستجواب وظيفة جينية معينة أو ثقافة مشتركة لتحديد التفاعلات في البيئة المكروية للورم التي تؤثر على التحول. وقد مكنتنا هذه التقنية من التحقيق في ظواهر مثل العدوى الجزئية EMT و HPV ، إلى جانب تفاعلها مع الجهاز المناعي في بيولوجيا سرطانات الخلايا الحرشفية في الجهاز الهضمي.
