يمكن إنشاء ثقافات أنبوبية الكلى من أنسجة الكلى السليمة ومن البول مما يسمح لتوليد نماذج تمثيلية لدراسة أمراض الكلى وعلم وظائف الأعضاء. يسمح هذا البروتوكول بتوليد درنات الكلى السليمة من الأنسجة والبول ، وهذا الأخير هو طريقة غير عملية وصديقة للمرضى للحصول على مواد لتوليد الثقافات. يمكن استخدام ثقافات التوبولويد لدراسة فسيولوجيا الكلى ونمذجة الأمراض، مثل أمراض الكلى المعدية والخبيثة والوراثية.
لتوليد أنبوبات الكلى البشرية من الأنسجة، ضع عينة أنسجة الكلى في ملليلتر واحد من DMEM المتقدمة بالإضافة إلى متوسط زائد في طبق بيتري 10 سنتيمتر واستخدام المشرط لفرم الأنسجة إلى قطع من حجم ملليمتر مكعب واحد تقريبا. استخدم ملقط ومشرط لنقل قطع الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر وغسل الطبق مع خمسة ملليلتر من المتوسط الطازج. استخدام ماصة معقمة 10 ملليلتر لنقل المتوسطة إلى الأنبوب.
رواسب قطع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق بيليه في ثلاثة إلى أربعة ملليلترات من محلول الكولاجيناز. احتضان الأنسجة على شاكر أفقي في 37 درجة مئوية و 250 ثورة في الدقيقة الواحدة لمدة 45 إلى 60 دقيقة مع اهتزاز قوي كل 15 دقيقة. عندما يكون التعليق متجانسا وهضم معظم قطع الأنسجة ، املأ الأنبوب بمزيج متوسط خمس إلى عشر مرات عن طريق الانعكاس.
الطرد المركزي التعليق. إذا كانت الكريات حمراء، أضف ملليلتر واحد من العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الأنبوب لاحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، اغسل الأنبوب بوسط طازج.
إذا كانت قطع الأنسجة لا تزال مرئية، إعادة إنفاق بيليه مع خمسة ملليلتر من المتوسطة الطازجة وتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب 50 ملليلتر. نقل التعليق المصفى إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر للطرد المركزي واستخدام ماصة P1000 تعيين إلى حجم معروف لقياس حجم بيليه الخلية. إعادة إنفاق بيليه بعناية دون خلق فقاعات الهواء واحتضان الخلايا لمدة دقيقة واحدة على الجليد.
في نهاية الحضانة ، أعيد إنفاق بيليه في حجم 70 إلى 75٪ من مستخلص غشاء الطابق السفلي ولوحة قطرات 15 ميكرولتر من التعليق الناتج في لوحة ثقافة خلايا متعددة الآبار دافئة 37 درجة. عندما تكون جميع قطرات مطلية، واحتضان لوحة رأسا على عقب في 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة، ثم إضافة الحجم المناسب من 37 درجة مئوية المتوسطة الثقافة الدافئة، وتفقد الثقافات تحت المجهر برايتفيلد. لتوليد درنات الكلى البشرية من البول، تقسيم عينة البول بالتساوي بين أنابيب 50 ملليلتر وغسل العينات مرتين مع 10 إلى 20 ملليلتر من متوسط الغسيل الطازج لكل غسل.
بعد الغسيل الثاني، قم بإعادة تثبيت الكريات في الحيوانات العملاقة المتبقية وتجمع العينات في أنبوب واحد 15 ملليلتر لطارد مركزي ثالث. قياس حجم بيليه الخلية كما هو موضح وإعادة إنفاق بعناية بيليه دون خلق فقاعات الهواء. بعد دقيقة واحدة حضانة في الجليد، وإعادة إنفاق بيليه في حجم 70 إلى 75٪ من استخراج غشاء الطابق السفلي ولوحة 15 قطرات ميكرولتر من التعليق الناتج في 37 درجة مئوية دافئة لوحات ثقافة الخلايا متعددة الآبار كما هو موضح، ثم احتضان قطرات رأسا على عقب لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل إضافة متوسطة جديدة وعرض الثقافات عن طريق المجهر الخفيف.
بعد أسبوع إلى أسبوعين من أي نوع من الثقافة، استخدم ماصة P1000 لتعطيل قطرات الدرنات في كل بئر باستخدام الطرف لكشط قيعان الآبار لجمع الخلايا المرفقة. اسحب محتويات البئر في أنبوب واحد 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من DMEM المتقدمة بالإضافة إلى زائد متوسط وجمع الدرنات عن طريق الطرد المركزي. استنادا إلى حجم بيليه, إضافة عامل استبدال تريبسين تكملها مع 10 ميكرومولار Y27632 لاحتضان خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، استخدم طرف ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف ماصة 10 ميكرولتر يوضع فوق الطرف لمواصة تعليق التوبيلويد 20 إلى 30 مرة. تحقق تحت المجهر لمعرفة ما إذا كان أي tubuloids سليمة لا تزال موجودة داخل الأنبوب. أقل من 10٪ من tubuloids سليمة موجودة، وملء أنبوب مع DMEM المتقدمة الطازجة بالإضافة إلى زائد، وجمع tubuloids عن طريق الطرد المركزي للسماح لحجم بيليه أن تقاس كما هو موضح.
Resuspend بيليه في حجم 70 إلى 75٪ من استخراج غشاء الطابق السفلي ولوحة 15 قطرات ميكرولتر في 37 درجة مئوية دافئة لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار. بعد 15 إلى 20 دقيقة رأسا على عقب الحضانة في 37 درجة مئوية، إضافة المتوسطة ثقافة ما قبل الدافئة إلى قطرات وتفقد الثقافة عن طريق المجهر الخفيف. الأنابيب الناتجة عن عينات أنسجة الكلى تظهر عادة في غضون سبعة أيام من إنشاء الثقافة وتحتاج إلى أن تمر في غضون أسبوع إلى أسبوعين من الطلاء.
في ثقافات البول ، تظهر هياكل الدرنات المدمجة والخلايا الملتصقة بعد 14 إلى 21 يوما تقريبا من الطلاء ويحدث أول عملية تمرير بشكل عام بين ثلاثة وأربعة أسابيع. يزيد وجود الدرنات الظهارية الكيسية مع كل مرور. يمكن تقييم الجيل الناجح من ثقافات أنبوبي الكلى البشرية عن طريق تلطيخ المناعة الكيميائية للعلامات المعبر عنها في ظهارة الكلى الأنبوبية ، مثل جين الصندوق المقترن 8 البروتين.
التوقيت الصحيح للهضم الأنزيمي لمواد الأنسجة والمعالجة السريعة لعينات البول هي خطوات حاسمة للنتيجة الناجحة لهذه البروتوكولات. يمكن أن تمهد الكفاءة العالية لإنشاء ثقافات أنبوبية الكلى الطريق لاختبار المريض الخاص للسمية الكلوية الناجمة عن المخدرات ، وهو أحد الآثار الجانبية الشائعة للعديد من العلاج الكيميائي.
