从组织和尿液中产生人类肾脏结核

肾脏管状培养物可以从健康的肾脏组织和尿液中建立，从而产生研究肾脏疾病和生理学的代表性模型。该协议允许从组织和尿液中产生健康的肾管状体，后者是一种非侵入性和患者友好的方式，为一代文化获取材料。Tubuloid 培养物可用于研究肾脏生理学和疾病建模，如传染性、恶性和遗传性肾脏疾病。

要从组织中生成人体肾管状物，请将肾脏组织样本放入一毫升高级 DMEM 加加中等的 10 厘米培养皿中，并使用手术刀将组织切碎成大约一立方毫米大小的碎片。使用钳子和手术刀将组织件转移到 15 毫升管中，并用 5 毫升新鲜介质洗碗。使用无菌 10 毫升移液器将介质转移到管中。

通过离心沉积组织碎片，并将颗粒重新沉积在三到四毫升的拼贴液溶液中。将组织在37摄氏度和每分钟250转的水平摇床上孵育45至60分钟，每15分钟剧烈摇晃一次。当悬浮是同质的，并且大部分组织块被消化时，用介质填充管子，通过反转混合5到10次。

离心悬挂。如果颗粒为红色，在管中加入一毫升红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育五分钟。在孵化结束时，用新鲜的介质清洗管子。

如果组织碎片仍然可见，则用 5 毫升新鲜介质重新使用颗粒，并通过 100 微米细胞过滤器将悬浮物过滤成 50 毫升管。将过滤的悬架转移到新的 15 毫升管中进行离心，并使用 P1000 移液器设置为已知体积来测量细胞颗粒的体积。小心地重新悬空颗粒，而不会产生气泡，并在冰上孵育细胞一分钟。

在孵化结束时，将颗粒重新沉积在70%至75%体积的地下室膜提取物和板15微升液滴中，从而悬浮在37度加热的多井细胞培养板中。当所有的液滴都镀好后，在37摄氏度下倒置板，15至20分钟，然后加入37摄氏度的适当体积加热培养介质，并在明亮的显微镜下检查培养物。要从尿液中产生人类肾脏管状物，将尿样平均划分在50毫升管之间，每次洗涤用10至20毫升的新鲜洗涤介质清洗样品两次。

第二次清洗后，将颗粒重新放在残余的超分子中，并将样品汇集在单个 15 毫升管中进行第三次离心。测量细胞颗粒体积，并小心地重新悬空颗粒，而不会产生气泡。在冰中孵育一分钟后，将颗粒重新沉积在70%至75%体积的地下室膜提取物中，并将由此产生的悬浮物的15微升液滴在37摄氏度的高温下加热多井细胞培养板，然后倒置孵化液滴15至20分钟，然后加入新鲜介质，通过光显微镜观察培养物。

经过一到两周的培养，使用P1000移液器破坏每个油井的管状液滴，使用尖端刮水井底部收集附着的细胞。将井内物品拉入单个 15 毫升管中，其中含有 10 毫升高级 DMEM 加加介质，并通过离心收集管状物。根据颗粒的大小，加入试丁脂替代剂，辅以10微摩尔Y27632，在37摄氏度下孵育5分钟。

在孵化结束时，使用 1000 微升移液器尖端，在尖端放置 10 微升移液器尖端，以移液器管状悬架 20 至 30 次。在显微镜下检查管内是否仍然存在任何完整的管状管。它不到10%的完整的管状体存在，填补管与新鲜先进的DMEM加加，并通过离心收集管状体，使颗粒体积测量证明。

在 37 摄氏度加热的多井细胞培养板中，将颗粒重新沉积在 70% 到 75% 体积的地下室膜提取物和 15 微升液滴中。在37摄氏度的15至20分钟倒置孵化后，在液滴中加入预加热培养介质，并通过光显微镜检查培养物。从肾脏组织样本中产生的结节通常出现在培养后的七天内，需要在电镀后一到两周内通过。

在尿液培养中，紧凑的管状结构和粘附细胞在电镀后大约14至21天出现，第一次通气一般发生在3至4周之间。囊性上皮管状体的存在随着每段通道的增加而增加。成功一代的人类肾管状培养物可以通过免疫组织化学染色来评估管状肾上皮中表达的标记物，如配对盒基因8蛋白。

组织材料的酶消化和尿样快速处理的正确时机是这些协议成功的关键步骤。肾管培养物培养物的高效建立可以为患者特定于药物引起的肾毒性检测铺平道路，这是许多化疗药物的常见副作用。