דור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות ושתן

תרביות טובולואיד כליות ניתן להקים מרקמת כליה בריאה ומשתן המאפשר את הדור של מודלים מייצגים ללמוד מחלת כליות ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של טובולואידים כליות בריאים מרקמות ושתן, האחרון להיות דרך לא פולשנית וידידותית למטופל להשיג חומר ליצירת תרבויות. ניתן להשתמש בתרביות טובולואידיות לחקר פיזיולוגיה של הכליות ולדוגמנות מחלות, כגון מחלות כליות זיהומיות, ממאירות ותורשתיות.

כדי ליצור טובולואידים כליות אנושיים מרקמות, למקם את דגימת רקמת הכליה לתוך מיליליטר אחד של DMEM מתקדם פלוס פלוס בינוני בצלחת פטרי 10 ס"מ ולהשתמש אזמלים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות של גודל מעוקב אחד בקירוב. השתמש במלקחיים ואזמלים כדי להעביר את חתיכות הרקמה לצינור 15 מיליליטר ולשטוף את הצלחת עם חמישה מיליליטר של מדיום טרי. השתמש בצינור סטרילי 10 מיליליטר כדי להעביר את המדיום לצינור.

משקעים את חתיכות הרקמה על ידי צנטריפוגה ו resuspened הכדור בשלושה עד ארבעה מיליליטר של תמיסת collagenase. לדגור את הרקמות על שייקר אופקי ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סיבובים לדקה במשך 45 עד 60 דקות עם רועד נמרץ כל 15 דקות. כאשר ההשעיה הומוגנית ורוב חתיכות הרקמה התעכלו, מלאו את הצינור בינוני וערבבו חמש עד 10 פעמים על ידי היפוך.

צנטריפוגה ההשעיה. אם הכדור אדום, הוסף מיליליטר אחד של חיץ תמה של תאי דם אדומים לצינור לדגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הצינור עם מדיום טרי.

אם חתיכות של רקמות עדיין גלויות, resuspend הכדור עם חמישה מיליליטר של מדיום טרי ולסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תאים 100 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר. העבר את המתלים המסוננים לצינור חדש של 15 מיליליטר לצנטריפוגה והשתמש בפיפטה P1000 המוגדרת לאמצעי אחסון ידוע כדי למדוד את נפח גלולה התא. בזהירות resuspend הכדור מבלי ליצור בועות אוויר ודגורת התאים במשך דקה אחת על קרח.

בסוף הדגירה, resuspend הכדור בנפח 70 עד 75% של תמצית קרום המרתף צלחת 15 טיפות microliter של ההשעיה וכתוצאה מכך בצלחת תרבית תאים מרובת בארות מחומם 37 מעלות. כאשר כל הטיפות כבר מצופות, לדגור על הצלחת הפוך ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן להוסיף את הנפח המתאים של 37 מעלות צלזיוס מחומם תרבות בינוני, ולבדוק את התרבויות תחת מיקרוסקופ Brightfield. כדי ליצור טובולואידים כליות אנושיים משתן, לחלק את דגימת השתן באופן שווה בין 50 צינורות מיליליטר לשטוף את הדגימות פעמיים עם 10 עד 20 מיליליטר של מדיום כביסה טרי לכל לשטוף.

לאחר הכביסה השנייה, resuspend הכדורים ב supernatants שיורית שלהם ולאגד את הדגימות בצינור יחיד 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה שלישית. מדוד את נפח גלולה התא כפי שהודגם בזהירות resuspend הכדור מבלי ליצור בועות אוויר. לאחר דקה אחת דגירה בקרח, resuspened הכדור בנפח 70 עד 75 אחוזים של תמצית קרום המרתף צלחת 15 טיפות מיקרוליטר של ההשעיה וכתוצאה מכך ב 37 מעלות צלזיוס חימם לוחות תרבית תאים רב-באר כפי שהודגם, ולאחר מכן לדגור את הטיפות הפוך במשך 15 עד 20 דקות לפני הוספת מדיום טרי וצפייה בתרבויות על ידי מיקרוסקופיה קלה.

לאחר שבוע עד שבועיים של כל סוג של תרבות, השתמש בפיפטה P1000 כדי לשבש את טיפות טובולואיד בכל באר באמצעות הקצה כדי לגרד את תחתית הבארות כדי לאסוף את התאים המצורפים. משוך את תכולת הבאר בצינור יחיד 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DMEM מתקדם פלוס פלוס בתוספת בינוני ולאסוף את טובולואידים על ידי צנטריפוגה. בהתבסס על גודל הכדור, להוסיף סוכן תחליף טריפסין בתוספת 10 micromolar Y27632 עבור דגירה של חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, השתמש 1, 000 טיפ פיפטה מיקרוליטר עם קצה פיפטה 10 מיקרוליטר להציב מעל הקצה כדי pipette מתלה טובולואיד 20 עד 30 פעמים. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם כל טובולואידים שלמים עדיין קיימים בתוך הצינור. זה פחות מ -10% של טובולואידים שלמים נמצאים, למלא את הצינור עם DMEM מתקדם טרי פלוס פלוס, ולאסוף את טובולואידים על ידי צנטריפוגה כדי לאפשר את נפח הכדור להימדד כפי שהודגם.

resuspend הכדור בנפח 70 עד 75 אחוזים של תמצית קרום המרתף צלחת 15 טיפות מיקרוליטר בצלחת תרבית תאים רב-טובה 37 מעלות צלזיוס חיממה. לאחר דגירה הפוכה של 15 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, הוסיפו מדיום תרבות מחמם מראש לטיפה ובחנו את התרבות באמצעות מיקרוסקופיה קלה. טובולואידים הנוצרים מדגימות רקמת כליה מופיעים בדרך כלל בתוך שבעה ימים של הקמת תרבות ויש להעביר בתוך שבוע עד שבועיים של ציפוי.

בתרביות שתן, מבנים טובולואידים קומפקטיים ותאים דבקים מופיעים כ 14 עד 21 ימים לאחר ציפוי ועובר ראשון מתרחש בדרך כלל בין שלושה לארבעה שבועות. הנוכחות של טובולואידים אפיתל ציסטי עולה עם כל מעבר. הדור המוצלח של תרביות טובולואיד כליות אנושיות ניתן להעריך על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סמנים לידי ביטוי אפיתל כליות צינורי, כגון חלבון גן תיבת מזווג 8.

תזמון נכון של עיכול אנזימטי של חומר רקמות ועיבוד מהיר של דגימות שתן הם צעדים מכריעים לתוצאה המוצלחת של פרוטוקולים אלה. היעילות הגבוהה של הקמת תרביות טובולואיד כליות יכול לסלול את הדרך לבדיקה ספציפית למטופל של nephrotoxicity הנגרמת על ידי תרופות, תופעת לוואי נפוצה של כימותרפיה רבים.