Почечные тубулоидные культуры могут быть получены из здоровой почечной ткани и мочи, что позволяет создавать репрезентативные модели для изучения заболеваний почек и физиологии. Этот протокол позволяет выгенерирование здоровых почечных тубулоидов из тканей и мочи, причем последние являются неинвазивным и удобным для пациента способом получения материала для генерации культур. Тубулоидные культуры могут быть использованы для изучения физиологии почек и для моделирования заболеваний, таких как инфекционные, злокачественные и наследственные заболевания почек.
Чтобы получить человеческие почечные тубулоиды из ткани, поместите образец почечной ткани в один миллилитр продвинутого DMEM плюс плюс плюс среда в 10-сантиметровую чашку Петри и используйте скальпели, чтобы измельчить ткань на кусочки размером примерно один кубический миллиметр. Используйте щипцы и скальпели, чтобы перенести кусочки ткани в 15-миллилитровый тюбик и вымыть посуду пятью миллилитрами свежей среды. Используйте стерильную 10-миллилитровую пипетку для переноса среды в трубку.
Осадите кусочки ткани центрифугированием и повторно суспендировать гранулу в трех-четырех миллилитрах раствора коллагеназы. Инкубируют ткани на горизонтальном шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение 45-60 минут с энергичным встряхиванием каждые 15 минут. Когда суспензия однородна и большая часть кусочков ткани переварена, заполните трубку средой и перемешайте от пяти до 10 раз путем инверсии.
Центрифуга суспензии. Если гранула красного цвета, добавьте один миллилитр буфера лизиса эритроцитов в трубку для пятиминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промыть тюбик свежей средой.
Если кусочки ткани все еще видны, повторно суспендируют гранулу пятью миллилитрами свежей среды и фильтруют суспензию через 100-микрон клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Перенесите отфильтрованную суспензию в новую 15-миллилитровую трубку для центрифугирования и используйте пипетку P1000, установленную в известном объеме, для измерения объема гранулы ячейки. Тщательно повторно суспендировать гранулу без образования пузырьков воздуха и высиживайте клетки в течение одной минуты на льду.
В конце инкубации повторно суспендируют гранулу в 70-75% объеме экстракта базальной мембраны и пластине 15 микролитров полученной суспензии в 37-градусной нагретой многоязыковой клеточной культуральной пластине. Когда все капли будут покрыты, высиживайте пластину вверх ногами при 37 градусах Цельсия в течение 15-20 минут, затем добавьте соответствующий объем нагретой питательной среды 37 градусов Цельсия и осмотрите культуры под ярким микроскопом. Чтобы получить человеческие почечные тубулоиды из мочи, разделите образец мочи поровну между 50 миллилитрами пробирок и промывайте образцы два раза с 10-20 миллилитрами свежей моющей среды за одну промывку.
После второй промывки повторно суспендируют гранулы в их остаточных супернатантах и объединяют образцы в одну 15-миллилитровую трубку для третьей центрифугирования. Измерьте объем гранулы ячейки, как показано на продемонстрированном, и тщательно повторно суспендируем гранулу, не создавая пузырьков воздуха. После одной минуты инкубации во льду повторно суспендируют гранулу в 70-75% объеме экстракта базальной мембраны и пластине 15 микролитров капель полученной суспензии в 37 градусах Цельсия, нагретых многоязыковых пластин клеточных культур, как показано, затем инкубируют капли вверх ногами в течение 15-20 минут, прежде чем добавлять свежую среду и просматривать культуры с помощью световой микроскопии.
После одной-двух недель любого типа культуры используйте пипетку P1000, чтобы разрушить тубулоидные капли в каждой скважине, используя наконечник для соскабливания дна скважин для сбора прикрепленных клеток. Вытяните содержимое скважины в одну 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров усовершенствованной среды DMEM плюс плюс плюс, и соберите тубулоиды путем центрифугирования. В зависимости от размера гранулы, добавьте заместитель трипсина, дополненное 10 микромоляром Y27632 для пятиминутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации используйте наконечник пипетки на 1000 микролитров с наконечником пипетки 10 микролитр, помещенным над наконечником, чтобы пипетку тубулоидной суспензии от 20 до 30 раз. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, присутствуют ли какие-либо неповрежденные тубулоиды в трубке. В нем присутствует менее 10% интактных тубулоидов, заполняют трубку свежим усовершенствованным DMEM плюс плюс плюс и собирают тубулоиды путем центрифугирования, чтобы можно было измерить объем гранул, как показано.
Повторно суспендировать гранулу в объеме от 70 до 75% объема экстракта базальной мембраны и пластине 15 микролитровых капель в нагретой многоязыковой пластине для культивирования клеток с 37 градусами Цельсия. После 15-20-минутной переворачивания при 37 градусах Цельсия добавьте к каплям предварительно нагретую питательную среду и осмотрите культуру с помощью световой микроскопии. Тубулоиды, полученные из образцов почечной ткани, обычно появляются в течение семи дней после создания культуры и должны быть проработаны в течение одной-двух недель после нанесения покрытия.
В культурах мочи компактные тубулоидные структуры и адгезивные клетки появляются примерно через 14-21 день после покрытия, и первое прохождение обычно происходит между тремя и четырьмя неделями. Наличие кистозных эпителиальных тубулоидов увеличивается с каждым проходом. Успешное формирование тубулоидных культур почек человека может быть оценено иммуногистохимическим окрашиванием маркеров, экспрессируемых в трубчатом эпителии почек, таких как парный белок бокс-гена 8.
Правильные сроки ферментативного переваривания тканевого материала и быстрая обработка образцов мочи являются решающими шагами для успешного исхода этих протоколов. Высокая эффективность создания тубулоидных культур почек может проложить путь для специфического для пациента тестирования лекарственной нефротоксичности, распространенного побочного эффекта многих химиотерапевтических средств.
