Le colture tubuloidi renali possono essere stabilite dal tessuto renale sano e dall'urina consentendo la generazione di modelli rappresentativi per studiare la malattia e la fisiologia renale. Questo protocollo consente la generazione di tubuloidi renali sani da tessuti e urine, quest'ultimo è un modo non invasivo e a misura di paziente per ottenere materiale per la generazione di colture. Le colture tubuloidi possono essere utilizzate per studiare la fisiologia renale e per la modellazione delle malattie, come le malattie renali infettive, maligne ed ereditarie.
Per generare tubuloidi renali umani dal tessuto, posizionare il campione di tessuto renale in un millilitro di DMEM avanzato più più più mezzo in una capsula di Petri di 10 centimetri e utilizzare bisturi per tritare il tessuto in pezzi di circa un millimetro cubo. Utilizzare pinci e bisturi per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo da 15 millilitri e lavare il piatto con cinque millilitri di mezzo fresco. Utilizzare una pipetta sterile da 10 millilitro per trasferire il mezzo al tubo.
Sedimentare i pezzi di tessuto mediante centrifugazione e risusciere il pellet in tre o quattro millilitri di soluzione di collagenasi. Incubare i tessuti su uno shaker orizzontale a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto per 45-60 minuti con un vigoroso scuotimento ogni 15 minuti. Quando la sospensione è omogenea e la maggior parte dei pezzi di tessuto sono stati digeriti, riempire il tubo con il mezzo e mescolare da cinque a 10 volte per inversione.
Centrifugare la sospensione. Se il pellet è rosso, aggiungere un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi al tubo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare il tubo con mezzo fresco.
Se i pezzi di tessuto sono ancora visibili, risusciendi il pellet con cinque millilitri di mezzo fresco e filtra la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un tubo da 50 millilitri. Trasferire la sospensione filtrata in un nuovo tubo da 15 millilitro per la centrifugazione e utilizzare una pipetta P1000 impostata su un volume noto per misurare il volume del pellet cellulare. Risusediare con cura il pellet senza creare bolle d'aria e incubare le cellule per un minuto sul ghiaccio.
Alla fine dell'incubazione, risusedere il pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e in una piastra di 15 goccioline di microlitro della sospensione risultante in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo riscaldata a 37 gradi. Quando tutte le goccioline sono state placcate, incubare la piastra a testa in giù a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti, quindi aggiungere il volume appropriato di 37 gradi Celsius di terreno di coltura riscaldato e ispezionare le colture al microscopio a campo luminoso. Per generare tubuloidi renali umani dall'urina, dividere equamente il campione di urina tra 50 tubi da 50 millilitri e lavare i campioni due volte con 10-20 millilitri di mezzo di lavaggio fresco per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, risospenare i pellet nei loro supernatanti residui e mettere insieme i campioni in un unico tubo da 15 millilitri per una terza centrifugazione. Misurare il volume del pellet della cella come dimostrato e risusediare attentamente il pellet senza creare bolle d'aria. Dopo un minuto di incubazione nel ghiaccio, risuscidere il pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e placcare 15 goccioline di microlitro della sospensione risultante in piastre di coltura cellulare multi-pozzo riscaldate a 37 gradi Celsius come dimostrato, quindi incubare le goccioline capovolte per 15-20 minuti prima di aggiungere terreno fresco e visualizzare le colture al microscopio ottico.
Dopo una o due settimane di entrambi i tipi di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per interrompere le goccioline tubuloidi in ciascun pozzetto usando la punta per raschiare il fondo dei pozzetti per raccogliere le cellule attaccate. Tirare il contenuto del pozzo in un singolo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM avanzato più più più mezzo e raccogliere i tubuloidi per centrifugazione. In base alle dimensioni del pellet, aggiungere l'agente sostitutivo della tripsina integrato con 10 micromolari Y27632 per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microlitteri con una punta di pipetta da 10 microlitter posta sopra la punta per pipettare la sospensione tubuloide da 20 a 30 volte. Controllare al microscopio per vedere se ci sono ancora tubuloidi intatti all'interno del tubo. Sono presenti meno del 10% di tubuloidi intatti, riempire il tubo con DMEM plus plus plus fresco avanzato e raccogliere i tubuloidi mediante centrifugazione per consentire di misurare il volume del pellet come dimostrato.
Spese di sospensione del pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e di goccioline di microlitro da 15 microlitri in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo riscaldata a 37 gradi Celsius. Dopo un'incubazione capovolta di 15-20 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere un terreno di coltura preriscaldato alle goccioline e ispezionare la coltura al microscopio ottico. I tubuloidi generati da campioni di tessuto renale compaiono in genere entro sette giorni dall'istituzione della coltura e devono essere passaggi entro una o due settimane dalla placcatura.
Nelle colture di urina, le strutture tubuloidi compatte e le cellule aderenti compaiono circa 14-21 giorni dopo la placcatura e il primo passaggio si verifica generalmente tra tre e quattro settimane. La presenza di tubuloidi epiteliali cistici aumenta ad ogni passaggio. La generazione di successo di colture tubuloidi renali umane può essere valutata mediante colorazione immunoistochimica per marcatori espressi nell'epitelio renale tubulare, come la proteina 8 del gene box accoppiato.
Una corretta tempistica della digestione enzimatica del materiale tissutale e una rapida elaborazione dei campioni di urina sono passaggi cruciali per il buon esito di questi protocolli. L'elevata efficienza della creazione di colture tubuloidi renali può aprire la strada a test specifici per il paziente della nefrotossicità indotta da farmaci, un effetto collaterale comune di molti chemioterapici.
