腎臓結管状培養は、健康な腎臓組織と尿から確立され、腎臓病や生理学を研究するための代表的なモデルの生成を可能にする。このプロトコルは、組織および尿から健康な腎臓結管状の結腸の生成を可能にし、後者は培養物の生成のための材料を得る非侵襲的で患者に優しい方法である。尿管状培養物は、腎臓生理学の研究や、感染性、悪性、遺伝性腎臓病などの疾患モデリングに使用できます。
組織からヒト腎臓結管状管状突起を生成するには、腎臓組織サンプルを高度なDMEMプラスプラスミディアムの1ミリリットルに10センチメートルペトリ皿に入れ、メスを使用して組織を約1立方ミリメートルの大きさの断片にミンチします。鉗子とメスを使用して、組織片を15ミリリットルのチューブに移し、新鮮な媒体を5ミリリットルで洗います。チューブに媒体を転送するために滅菌10ミリリットルピペットを使用してください。
遠心分離によって組織片を沈下し、コラゲナーゼ溶液の3〜4ミリリットルでペレットを再懸濁する。15分ごとに激しく揺れ、摂氏37度で水平シェーカーに組織をインキュベートし、毎分250回転を45〜60分間インキュベートします。懸濁液が均質で、組織片のほとんどが消化された場合は、チューブを培地で満たし、反転によって5〜10回混合します。
サスペンションを遠心分離します。ペレットが赤の場合は、室温で5分間インキュベーションするために、チューブに赤血球のライシスバッファーを1ミリリットル加えます。インキュベーションの終わりに、新鮮な媒体でチューブを洗います。
組織の破片がまだ見える場合は、新鮮な媒体の5ミリリットルでペレットを再サスペンドし、50ミリリットルのチューブに100ミクロンの細胞ストレーナーを介して懸濁液を濾過します。濾過した懸濁液を遠心分離のために新しい15ミリリットルチューブに移し、P1000ピペットセットを既知の体積にセットして細胞ペレットの体積を測定します。気泡を作らずに慎重にペレットを再懸濁し、氷の上で1分間細胞をインキュベートします。
インキュベーションの終了時に、得られた懸濁液の70〜75%体積の原膜抽出物およびプレート15マイクロリットルの液滴を37度温めたマルチウェル細胞培養プレートにペレットを再懸濁させる。すべての液滴がメッキされたら、プレートを37°Cで15〜20分間逆さまにインキュベートし、適切な体積37°Cの温めた培養培地を加え、明視野顕微鏡で培養を検査します。尿からヒト腎臓結節を生成するには、尿サンプルを50ミリリットルのチューブに均等に分け、1回の洗浄ごとに10〜20ミリリットルの新鮮な洗浄媒体でサンプルを2回洗浄する。
2回目の洗浄後、ペレットを残りの上清に再び懸濁し、サンプルを15ミリリットルチューブにプールして3回目の遠心分離を行います。示されているように細胞ペレットの体積を測定し、気泡を作成せずに慎重にペレットを再中断します。氷の中で1分間インキュベーションした後、ペレットを70〜75%体積の原膜抽出物に再懸濁し、得られた懸濁液の15マイクロリットルの液滴を摂氏37度温めたマルチウェル細胞培養プレートで再懸濁し、液滴を15〜20分間逆さまにインキュベートしてから、新鮮な培地を添加し、光顕微鏡で培養物を見る。
いずれのタイプの培養も1~2週間後に、P1000ピペットを使用して、先端を使用してウェルの底部を掻き取り、取り付けられた細胞を採取するために各ウェル内の管状小板を破壊する。高度なDMEMプラスプラス媒体の10ミリリットルを含む単一の15ミリリットルのチューブにウェル内容物を引っ張り、遠心分離によって管状体を収集します。ペレットの大きさに基づいて、トリプシン交換剤を加え、摂氏37度で5分間インキュベーションを行う10マイクロモルY27632を添加した。
インキュベーションの終わりに、1,000マイクロリットルピペットチップを先端の上に置いた1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、チューブロイド懸濁液を20〜30回ピペット化する。顕微鏡の下で、チューブ内に無傷のチューブロイドがまだ存在しているかどうかを確認します。それは、無傷の管状突起の10%未満が存在し、新鮮な高度なDMEMプラスプラスプラスでチューブを満たし、そして、ペレットの体積を実証されるように測定できるように遠心分離によって管状を収集する。
37°C温めたマルチウェル細胞培養プレートに70~75%の原膜抽出物およびプレート15マイクロリットルの液滴でペレットを再懸濁します。摂氏37度で15~20分の逆さまのインキュベーションを行った後、あらかじめ温めた培養培地を液滴に加え、光顕微鏡で培養を検査する。腎臓組織サンプルから生成された管状突起は、通常、培養の確立から7日以内に現れ、めっきの1〜2週間以内に継がれる必要がある。
尿培養では、コンパクトなチューブロイド構造および付着細胞は、めっきおよび最初の通過が一般的に3〜4週間の間に起こる約14〜21日後に現れる。嚢胞性上皮管状細管の存在は、各通路で増加する。ヒト腎臓結節培養物の生成に成功した結果は、ペアドボックス遺伝子8タンパク質などの管状腎臓上皮に発現するマーカーに対する免疫組織化学的染色によって評価することができる。
組織材料の酵素消化と尿サンプルの高速処理の正しいタイミングは、これらのプロトコルの成功の結果のための重要なステップです。腎臓結管状培養物の確立の高効率は、多くの化学療法薬の一般的な副作用である薬物誘発性腎毒性の患者特異的検査への道を開くことができる。
