Culturas tubuloides renais podem ser estabelecidas a partir de tecido renal saudável e da urina permitindo a geração de modelos representativos para estudar doenças renais e fisiologia. Este protocolo permite a geração de tubuloides renais saudáveis a partir de tecido e urina, sendo este último uma forma não invasiva e amigável ao paciente de obter material para geração de culturas. Culturas tubuloides podem ser usadas para estudar fisiologia renal e modelagem de doenças, como doenças renais infecciosas, malignas e hereditárias.
Para gerar tubuloides renais humanos a partir do tecido, coloque a amostra de tecido renal em um mililitro de DMEM avançado mais mais meio em uma placa de Petri de 10 centímetros e use bisturis para picar o tecido em pedaços de aproximadamente um milímetro cúbico. Use fórceps e bisturis para transferir os pedaços de tecido para um tubo de 15 mililitros e lave o prato com cinco mililitros de meio fresco. Use uma pipeta estéril de 10 mililitros para transferir o meio para o tubo.
Sedimentar os pedaços de tecido por centrifugação e resuspensar a pelota em três a quatro mililitros de solução de colagenase. Incubar os tecidos em um agitador horizontal a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto durante 45 a 60 minutos com agitação vigorosa a cada 15 minutos. Quando a suspensão for homogênea e a maioria dos pedaços de tecido tiverem digerido, encha o tubo com meio e misture de cinco a dez vezes por inversão.
Centrifugar a suspensão. Se a pelota estiver vermelha, adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao tubo para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave o tubo com meio fresco.
Se os pedaços de tecido ainda estiverem visíveis, resuspenja a pelota com cinco mililitros de meio fresco e filtre a suspensão através de um coador de células de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Transfira a suspensão filtrada para um novo tubo de 15 mililitros para centrifugação e use um conjunto de pipeta P1000 para um volume conhecido para medir o volume da pelota celular. Ressuspense cuidadosamente a pelota sem criar bolhas de ar e incubar as células por um minuto no gelo.
Ao final da incubação, resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas de microliter da suspensão resultante em uma placa de cultura celular multi-bem aquecida de 37 graus. Quando todas as gotículas tiverem sido emplacados, incubar a placa de cabeça para baixo a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos, em seguida, adicione o volume apropriado de 37 graus Celsius meio de cultura aquecida, e inspecione as culturas sob um microscópio de campo brilhante. Para gerar tubuloides renais humanos a partir da urina, divida a amostra de urina igualmente entre 50 tubos mililitros e lave as amostras duas vezes com 10 a 20 mililitros de meio de lavagem fresco por lavagem.
Após a segunda lavagem, resuspenja as pelotas em seus sobrenacantes residuais e acumule as amostras em um único tubo de 15 mililitros para uma terceira centrifugação. Meça o volume de pelotas celulares como demonstrado e resuspenja cuidadosamente a pelota sem criar bolhas de ar. Após um minuto de incubação no gelo, resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas microliter da suspensão resultante em 37 graus Celsius aqueceu placas de cultura celular multi-bem como demonstrado, em seguida, incubar as gotículas de cabeça para baixo por 15 a 20 minutos antes de adicionar meio fresco e ver as culturas por microscopia leve.
Após uma a duas semanas de qualquer tipo de cultura, use uma pipeta P1000 para interromper as gotículas tubuloides em cada poço usando a ponta para raspar os fundos dos poços para coletar as células anexadas. Puxe o conteúdo do poço em um único tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM avançado mais mais meio e colete os tubuloides por centrifugação. Com base no tamanho da pelota, adicione o agente de substituição de trippsina complementado com 10 micromolar Y27632 para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter com uma ponta de pipeta de 10 microliter colocada sobre a ponta para pipeta da suspensão tubuloide 20 a 30 vezes. Verifique sob o microscópio para ver se algum tubuloide intacto ainda está presente dentro do tubo. Menos de 10% dos tubuloides intactos estão presentes, encha o tubo com DMEM avançado fresco mais mais plus, e colete os tubuloides por centrífuga para permitir que o volume de pelotas seja medido como demonstrado.
Resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas de microliter em uma placa de cultura celular multi-bem aquecida de 37 graus Celsius. Depois de uma incubação de 15 a 20 minutos de cabeça para baixo a 37 graus Celsius, adicione meio de cultura pré-aquecido às gotículas e inspecione a cultura por microscopia leve. Os tubuloides gerados a partir de amostras de tecido renal normalmente aparecem dentro de sete dias do estabelecimento cultural e precisam ser passagemdos dentro de uma a duas semanas de revestimento.
Nas culturas de urina, estruturas tubuloides compactas e células aderentes aparecem aproximadamente 14 a 21 dias após o revestimento e a primeira passagem geralmente ocorre entre três e quatro semanas. A presença de tubuloides epiteliais císticos aumenta a cada passagem. A geração bem sucedida de culturas tubuloides renais humanos pode ser avaliada por coloração imunohistoquímica para marcadores expressos no epitélio renal tubular, como a proteína gene 8 da caixa emparelhada.
Um tempo correto de digestão enzimática do material tecidual e processamento rápido de amostras de urina são etapas cruciais para o resultado bem-sucedido desses protocolos. A alta eficiência do estabelecimento de culturas tubuloides renais pode abrir caminho para testes específicos do paciente de nefrotoxicidade induzida por drogas, um efeito colateral comum de muitos quimioterápicos.
