الهدف من هذا الإجراء هو قياس النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز في الخلايا. يتم قياس النشاط من خلال تحديد مستويات ميثيل الأرجينين والمستويات الإجمالية لبروتين العلامة الحيوية باستخدام النشاف الغربي الفلوري الكمي. ميزة الطريقة الموصوفة هي الأداء المباشر في أي مختبر مع ثقافة الخلية وقدرات البقع الغربية الفلورية.
وترد المبادئ التوجيهية التفصيلية بشأن العلامات الحيوية والأجسام المضادة والمانع مركبين في هذه المادة. وهنا وصفنا الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها الإجراء التجريبي. ويظهر الإجراء لتنسيق 24 جيدا.
أولا، إعداد العازلة تحلل، إضافة البنزوناز والبروتين كوكتيل مثبط طازجة قبل الاستخدام. إزالة كافة الوسائط من الآبار. غسل مع برنامج تلفزيوني 100 ميكرولتر، وإضافة 60 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى البئر.
احتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، هزاز لوحات لتوزيع العازلة تحلل على الخلايا. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من 20٪ SDS للعثور على تركيز 1٪، ومزيج عن طريق اهتزاز لطيف. نقل lysate في أنابيب Eppendorf ويبقيه على الجليد.
تحديد تركيز البروتين من العينات الخاصة بك باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA، أو استخدام أي طرق أخرى التي تتسامح مع 1٪ SDS في الحل. بعد ضبط تركيز البروتين مع العازلة تحلل لتكون متساوية عبر العينات في 20 ميكرولتر من أربع مرات تحميل العازلة إلى 60 ميكرولتر من lysate الخلية، والحرارة في 95 درجة لمدة خمس دقائق. إضافة البنزوناز إلى تحلل العازلة بسرعة الأحماض النووية الهيدروليز، والتي تقلل من لزوجة تحلل الخلية.
ليسات مع البنزوناز ليست لزجة. ليسات دون البنزوناز لديها غلوب كبيرة من الحمض النووي لزجة التي لن بيليه عندما نسج. تحميل إلى خمسة إلى 20 ميكروغرام من مجموع lysate الخلية لبروتينات الهستون، و 20 إلى 100 ميكروغرام للبروتينات الأخرى في التدرج أربعة إلى 12 بيس تريس هلام البروتين.
حول هلام في المماسح كما العازلة المحيطة بها لمدة ساعتين تقريبا في 100 فولت، أو حتى صبغة التحميل الأزرق تصل إلى الجزء السفلي من هلام. إذا قمت بإجراء نقل الرطب، وتجميع شطيرة نقل في الجليد الباردة تريس الجلايسين نقل العازلة. تنشيط غشاء PVDF عن طريق نقع في الميثانول وهلام متساوية في نقل العازلة لمدة 30 ثانية قبل التجميع.
ضع ورق فلتر الإسفنج وغشاء PVDF وهلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. نقل البروتينات في مخزن مؤقت نقل تريس الجليسين في 70 فولت لمدة ساعة إلى ساعة ونصف على الجليد. بعد النقل، واحتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في العازلة حجب.
شطف مع عازلة غسل، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات. في اليوم التالي، يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع مخزن الغسيل، ويحتضن بأجسام مضادة ثانوية تحمل علامة فلورية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع مخزن الغسيل المؤقت. ضع وجه الغشاء لأسفل على اللوحة الزجاجية لصور البقعة الغربية الفلورية.
تغطية مع ورقة مطاطية وإزالة أي فقاعات الهواء. قراءة إشارة في 700 و 800 نانومتر. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي، انتقل إلى الصورة وضبط 700 و 800 إشارة قناة لرؤية العصابات بوضوح.
هنا تمثل إشارة القناة 700 الموضحة باللون الأحمر مستويات البروتين الإجمالية، وتمثل إشارة القناة 800 الموضحة باللون الأخضر مستويات البروتين الميثيلي. بعد ذلك، انتقل إلى التحليل وحدد متوسط القراءة العلوية والسفلية. لقياس كثافة النطاقات، حدد رسم أداة المستطيل ورسم الشكل حول النطاقات التي تريد تحديدها كميا.
انتقل إلى الأشكال حيث تجد كثافة 700 و 800 قناة. العمود المسمى إشارة يوفر مستويات كثافة مع الخلفية طرح. يمكن نسخ النتائج مباشرة إلى ملف Excel.
هنا هو المثال الذي يظهر تحليل نشاط PRMT1 في الخلايا عند تثبيط مع PRMT نوع واحد مثبط MS023. يقاس نشاط PRMT1 من خلال تحديد مستويات ثنائي ميثيل ثنائي ميثيل الهستون H4 أرجينين 3 غير المتماثلة. هنا، ومستويات الميثيل، والعصابات الخضراء تنخفض بطريقة تعتمد على الجرعة، في حين أن مستويات الهستون الإجمالي العصابات الحمراء لا تزال دون تغيير.
لتحديد مركب IC50، رسم لوغارتم تركيز المانع ضد مستويات ثنائي ميثيل الهستون H4 أرجينين-3 غير المتماثلة تطبيع إلى مستويات الهستون الإجمالية تليها تحليل تناسب غير خطي. تسمح الطريقة الموصوفة بالكشف المزدوج المسؤول والتكرار عن نشاط ميثيل ترانسفيراز البروتيني في الخلايا. وميزة هذه الطريقة هي أنها تستخدم منهجية النشاف الغربية المعروفة التي يمكن الوصول إليها للمختبرات الأكاديمية ويمكن تعديلها بسهولة اعتمادا على معدات المختبر.
وترد تفاصيل الفحص بما في ذلك البروتينات علامة الحيوية والأجسام المضادة والكيميائية مركبين لكل فرد PRMT فرد من أفراد الأسرة في هذه المادة.
