Micropatterning هو تقنية قوية يستخدمها العلماء لفهم الاتصالات بين شكل الخلية ونشاط الآلات بين الخلايا. على الرغم من أن العديد من التقنيات تسمح للباحثين لتعديل شكل الخلية، فإن هذه التقنيات تتطلب في كثير من الأحيان معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها من قبل بعض مختبرات البيولوجيا. هذا الفيديو سوف يرشدك من خلال الخطوات اللازمة لأتمتة micropatterning على نظام التصوير متعددة الفوتون المتاحة تجاريا.
وإحدى مزايا هذا البروتوكول هي أنه يتجنب استخدام المعدات المتخصصة. يمكن أيضا تغيير الأنماط بسهولة دون إعادة تصنيع الكتل الضوئية ، والتي عادة ما تكون العملية الأكثر استهلاكا للوقت في micropatterning. لدينا أداة معالجة الصور يولد متوسط الصور الخلية التي تعكس توزيع تمثيلي للبروتينات بطريقة غير منحازة والآلية.
على الرغم من أننا نستخدم الأغطية في تجاربنا ، إلا أن سير العمل الآلي يسمح لك أيضا بالنمط على الشرائح والأطباق ذات القاع الزجاجي. العرض البصري لهذه الطريقة مهم لأن إعداد المجهر المناسب أمر بالغ الأهمية للنظام لتصوير وتحديد المستوى البؤري الصحيح والنمط بطريقة آلية. إعداد حل PVA حسب التعليمات.
إضافة جزء واحد HCL إلى ثمانية أجزاء PVA. عكس الأنبوب بعناية عدة مرات لخلط. صب اثنين من ملليلتر من الحل في طبق بيتري صغيرة وغمر غطاء نظيفة المعالجة مسبقا في السائل.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على شاكر. إزالة غطاء بعناية من الحل. استخدام الدوار coverslip لتدور معطف لمدة 40 ثانية.
في هذه الأثناء، نظف الملاقط. نقل غطاء إلى مربع والجافة في أربع درجات بين عشية وضحاها. قم بتشغيل برنامج المجهر.
أولا، تعيين خط الليزر إلى 750 نانومتر. ثم قم بإعداد تكوين بصري جديد يسمى ، صورة. هذا هو التكوين البصري الأساسي الذي يسمح لنا بتصوير الغطاء من خلال عاكسات.
اترك خيارات أخرى كخيار افتراضي وحدد الهدف المناسب. تكوين إعدادات الأجهزة ضمن هذا التكوين البصري. تعيين الليزر الأشعة تحت الحمراء كما لدينا ليزر التحفيز.
ضع مقسم الشعاع في مسار الضوء لاستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء للتصوير. حدد وحدة الماسح الضوئي غالفانو وكاشف المسح الضوئي D المناسبة. حدد حجم المسح الضوئي ووقت الإسهاب الكافي لالتقاط الميزات الصغيرة على غطاء الغطاء.
تأكد من تحديد المربع استخدام الليزر الأشعة تحت الحمراء. ضبط قوة الليزر اكتساب وحساسية كاشف للحصول على صورة مشرقة، ولكن ليس المشبعة، من سطح coverlip. في إطار منطقة المسح الضوئي، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى واحد لالتقاط حقل العرض بأكمله.
حفظ التكوين البصري. الآن سنقوم بإعداد سلسلة من التكوينات البصرية التي من شأنها أن تسمح للمجهر للتركيز، وتحميل قناع عائد الاستثمار وتوليد أنماط بطريقة آلية. التكوين البصري الأول يسمح لنا لطباعة علامة ائتمانية تستخدم للتركيز التلقائي على مجال الرؤية الحالي.
تكرار التكوين البصري للصورة وإعادة تسميتها، طباعة علامة ائتمانية. بما أننا نطبع في هذه الخطوة، حرك مقسم الحزمة من مسار الضوء واستبدله بمرآة ديكهروية مناسبة. حدد أصغر حجم مسح لتوفير الوقت.
نظرا لهذه الخطوة، لا يلزم التصوير، قم بتعيين حساسية الكاشف إلى الصفر. زيادة طاقة الليزر لتمكين الطباعة. في إطار منطقة المسح الضوئي، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى أقصى حد ووضع منطقة المسح في منتصف حقل العرض.
الآن سنقوم بإعداد تجربة Z-كومة لحساب أي تفاوت في سطح PVA. تعيين الحركة في الموضع Z إلى النسبي. حدد الجهاز Z المناسب.
بعد ذلك، كرر التكوين البصري للصورة وإعادة تسميتها، التركيز التلقائي. حدد أصغر حجم مسح ضوئي واختف عامل التكبير/التصغير في إطار منطقة المسح الضوئي بحيث يكون مجال الرؤية أكبر قليلا من علامة الالتصاط. وهذا يضمن أن الميزات الصغيرة الأخرى على غطاء لن تتداخل مع التركيز التلقائي.
في القائمة الأجهزة، حدد إعداد التركيز التلقائي. تعيين سمك المسح الضوئي إلى ذلك في تجربة Z-المكدس. المجهر سوف تفحص من خلال هذا النطاق والعثور على أفضل طائرة محورية باستخدام علامة ائتمانية.
بعد ذلك، قم بتكرار التكوين البصري للصورة وإعادة تسميته، تحميل عائد الاستثمار. تعيين حجم المسح الضوئي مطابقة لتلك التي قناع ROI لأنه سيتم تحميل القناع على صورة مأخوذة مع هذا التكوين البصري. استخدمنا 2048 بكسل لتحقيق التوازن الأمثل بين الدقة والسرعة.
الآن سنقوم بإعداد التكوين البصري المستخدمة لنمط coverlip. تكرار الطباعة التهيئة البصرية علامة ائتمانية وإعادة تسميته، Micropattern. تعيين عامل التكبير/التصغير إلى واحد.
زيادة قوة الليزر التحفيز ل ablate PVA. حدد سرعة مسح مناسبة. في إطار التحفيز ND، إعداد تجربة التحفيز ND.
إضافة بضع مراحل إلى الجدول الزمني وتعيين كل في التحفيز. تأكد من صحة منطقة التحفيز ومدته. في نفس النافذة، قم بتمكين المرحلة من نقل الدالة Z الرئيسية قبل كل مرحلة.
وهذا يمثل مرة أخرى أي انحرافات في اتجاه Z. وأخيرا، قم بإعداد تكوين بصري لإنشاء ملصق مرئي على غطاء الغطاء يمكن أن يساعدنا في تحديد موقع الأنماط. طباعة علامة ائتمانية مكررة وإعادة تسميته، سطح التسمية.
زيادة طاقة الليزر بشكل ملحوظ وتعيين التكبير إلى واحد. نقل غطاء المغلفة PVA على حامل. للحصول على مجهر مستقيم، تأكد من أن سطح PVA يواجه لأسفل.
إضافة الماء إلى زوايا لتحقيق الاستقرار في coverlip. جبل حامل على مرحلة المجهر. خفض الهدف وإضافة الماء في ما بين.
في برنامج المجهر، قم بتشغيل مصراع ليزر الأشعة تحت الحمراء واؤن محاذاة تلقائية قبل النقش. التبديل إلى التكوين البصري للصورة. مسح مجال الرؤية أثناء تحريك الهدف ببطء أقرب إلى غطاء.
في البداية، ستظهر الصورة باهتة للغاية. حرك الهدف أقرب إلى غطاء الغطاء حتى يزيد سطوع الصورة قليلا. هذا هو سطح الغطاء الذي يواجه الهدف.
الاستمرار في تحريك الهدف حتى ينخفض السطوع ويزيد مرة أخرى. هذا هو سطح PVA الذي سنقوم بنقشه. ركز على أي ميزة صغيرة، مثل عيوب الأغطية أو الغبار، وحدد صفرا على محرك الأقراص Z.
التبديل إلى التكوين البصري سطح التسمية. انقر على التقاط. العودة إلى التصوير والمسح الضوئي.
يظهر تلف الزجاج أن التسمية قد تمت طباعتها بنجاح. نقل المرحلة من جانب واحد إلى حقلين من الرؤية لتجنب جزيئات الزجاج. تفحص لتأكيد.
في قائمة الأجهزة، افتح ماكرو حركة المرحلة. تعيين المتغيرات M و N إلى العدد المطلوب من حقل طرق العرض التي سيتم نقش. حفظ الماكرو وتشغيله.
بعد اكتمال النقش، قم بالتبديل إلى التكوين البصري للصورة وافحص الأنماط. وينبغي أن يكون للجزر النمطية في كل مجال من مجالات الرؤية حدود واضحة وأن تعكس الضوء بالتساوي. الأنماط التي تظهر أكثر قتامة وغير متساو تشير إلى إزالة PVA غير مكتملة.
ويرجع ذلك عادة إلى عدم كفاية طاقة الليزر أو عدم صحة المستوى البؤري. إذا تم تعيين طاقة الليزر عالية جدا، فإنه يمكن أيضا أن يسبب PVA لفقاعة. بعد طلاء الخلايا على الأغطية ، يجب أن تنتشر الخلايا وتأخذ شكل النمط.
هذه صورة مناعة لورم ليفي بشري مطلي على نمط القوس والنشاب. تعرض الخلية حافة لاميلبوديا غنية بال أكتين. سميكة، ألياف الإجهاد البطني على طول الجانبين وألياف الإجهاد الظهري متصلة بالأقواس العرضية.
جلست سلسلة ضوء Myosin خلف حافة lamellipodia الكثيفة وعرضت نمطا المخطط على طول حزم أكتين. باستخدام أداة معالجة الصور المخصصة لدينا ، قمنا بتوليد صورة متوسطة لبروتيناتنا ذات الاهتمام. تظهر هذه الصورة أن هياكل actin الموضحة أعلاه متسقة عبر عدد كبير من الأنماط.
على الرغم من أننا نفقد الهياكل الفردية من الميوسين بعد المتوسط ، إلا أنه يتم الحفاظ على التعريب على طول حزم actin. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرا على إعداد سير عمل النقش الصغير باستخدام نظام متعدد الفوتون متاح تجاريا مع الحد الأدنى من العمل اليدوي. من المهم تحسين طاقة الليزر لنظامك الخاص لتجنب توليد أنماط غير مكتملة أو يمكن تحقيق أقصى قدر من الكفاءة PVA عن طريق ضبط المعلمات في خطوات التركيز البؤري التلقائي والتكييف الدقيق.
بالإضافة إلى التحقيق في المسارات الخلوية التي تنطوي على مورفولوجيا الخلايا ، يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا على فحص الأدوية والتطبيقات الأخرى الحساسة للاختلافات في شكل الخلية.
